叶酸壳聚糖川芎嗪纳米粒的制备及体外靶向性研究

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1、叶酸壳聚糖川芎嗪纳米粒的制备及体外靶向性研究计：学位论文：38页表格：7个插图：15幅程荔春指导教师：范青教授申请学位级别：硕士学位论文提交日期：2012年4月学位授予单位：大连医科大学专业名称：药理学论文答辩日期：2012年5月学位授予日期：2012年6月评阅人：答辩委员会主席：独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得大连医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并

2、表示谢意。学位论文作者签名：堑磁签字日期：生年上月卫日目录一、摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1(一)中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1(二)英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3二、正文⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6(一)前言⋯一⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·6(一)日IJ舌⋯一⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯’6(二)材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7(三)结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯12(四)讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

3、⋯⋯⋯⋯⋯23(五)结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯26(六)参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯27三、综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯DODgOO⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯30(一)综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3O(二)参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯35四、附录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯37五、致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯38叶酸壳聚糖川芎嗪纳米粒的制备及体外靶向性研究硕士生姓名：程荔春指导教师：范青教授指导小组：郝堂娜老师专业名称：药理学摘要目的：制备理化性质稳定的叶酸

4、壳聚糖川芎嗪纳米粒(主动靶向纳米粒)，研究其体外细胞靶向性，并初步探讨体外靶向分布的机制。方法：1．氧化降解法降解壳聚糖。乌氏粘度计测定不同降解时间壳聚糖的特性粘度，代入Mark．Houwink方程计算分子量。红外光谱分析壳聚糖、降解壳聚糖的特征吸收峰。2．氨基酰化反应合成叶酸壳聚糖。做红外图谱和核磁共振图谱，对叶酸壳聚糖结构表征进行分析；紫外分光光度法检测每分子壳聚糖上偶联的叶酸数。3．离子交联法制备主动靶向纳米粒。用分子量、偶联数不同的叶酸壳聚糖制备纳米粒，分别对其进行质量评价。HPLC法检测包封率、载药量，激光粒度分析仪检测粒径，透射电镜观察形态，体外恒温振荡法考察体外释药特性。4

5、．将顺浓度梯度的主动靶向纳米粒和空白纳米粒分别作用于叶酸受体高表达的人乳腺癌MCF．7细胞和叶酸受体阴性表达的人肺腺癌A549细胞，MTT法检测主动靶向纳米粒的细胞毒性。计算不同药物浓度下各细胞的生长率，选取纳米粒的无毒剂量(95％的细胞生长的药物浓度)为给药剂量。5．主动靶向纳米粒的细胞靶向分布研究。实验组用无毒剂量的主动靶向纳米粒作用于MCF一7细胞，对照组用相应的被动靶向纳米粒和川芎嗪溶液分别作用于MCF．7细胞，阴性对照组用无毒剂量的主动靶向纳米粒作用于A549细胞。分别作用不同时间后，HPLC法检测各组细胞内川芎嗪的浓度。激光共聚焦显微镜观察给药4小时后各组细胞内川芎嗪的荧光强

6、度。6．饱和受体法研究细胞靶向分布机制。实验组选用MCF一7细胞、A549细胞，分别给予高、中、低浓度的主动靶向纳米粒处理；对照组另选上述2种细胞，分别给予游离的叶酸进行处理，再给予高、中、低浓度的主动靶向纳米粒。作用4小时后，取样处理，HPLC法检测各组细胞内川芎嗪的浓度。结果：1．壳聚糖分子量的降低与降解反应时间呈依赖性。当降解反应2小时后，壳聚糖的分子量为5万，化学结构单元不发生变化，仅B糖苷键发生断键。2．与叶酸、壳聚糖红外图谱进行对比，经合成后的叶酸壳聚糖在1560cm_处出现了一个新的吸收峰，证明壳聚糖的游离氨基与叶酸的羧基形成了酰胺键。与壳聚糖核磁氢图谱相比，叶酸壳聚糖在位

7、移值3．26ppm和13．72ppm峰的积分强度增加，证明叶酸成功偶联到壳聚糖骨架上。经紫外分光光度法测得，当叶酸与壳聚糖摩尔配比为170：1时，每分子壳聚糖上所偶联的叶酸数为34个。3．制备出的主动靶向纳米粒粒径为182．7+0．56nm，包封率为59．6士0．23％，载药量为15．3土0．16％，纳米粒成圆球形，分散性好。主动靶向纳米粒具有缓释作用，体外缓慢释药到第3天，累积释放度可达95％，在偏酸性(pH6．5)介质中释药较中