叶酸介导靶向砒霜纳米粒的实验研究

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1、叶酸介导靶向砒霜纳米粒的实验研究【摘要】　　目的研究叶酸偶联牛血清白蛋白的合成工艺，制备包裹砒霜的白蛋白纳米粒并检验其对靶细胞的杀伤作用。方法叶酸在缩合剂的作用下与牛血清白蛋白偶联，通过正交设计选择最佳配方；用去溶剂法制备包裹砒霜的纳米粒，并观察其对靶细胞特异性杀伤作用。结果采用最佳条件合成的叶酸偶联牛血清白蛋白的偶联率为30.31μg/mg，纳米粒的砒霜包封率为10.3%，对靶细胞杀伤率为97%，对非靶细胞的杀伤力仅为23%。结论包裹有砒霜的叶酸偶联牛血清白蛋白纳米粒（简称F-BSANP）对靶细胞有特异性杀伤作用。

2、【关键词】砒霜；纳米粒；叶酸；牛血清白蛋白　　Abstract：ObjectiveTostudythesyntheticprocedureoffolate-conjugatedbovineserumalbumin(F-BSA)andpreparationofalbuminnanoparticlesentrappingarsenictrioxide，andtoexaminethepeculiartoxicityofnanoparticlesontargetingcells.MethodsFolicacidalbumin

3、viacondensingagent，ulaofF-BSAbytheorthogonaltestdesign．Thenanoparticlesethod，andthepeculiartoxicityofF-BSANPonA549adeinthebestformulag．TheentrappingrateofarsenictrioxideinedthepeculiartoxicityofF-BSANPontargetingcellsandcontrolgroupcells，respectively，andthedeat

4、hrateoftargetingcellsalbumin肿瘤是严重危害人类生命和健康的常见病和多发病，是导致残疾和早死的主要疾病之一。目前，临床使用的抗肿瘤化疗药物均有较大的毒副作用，有些严重的毒副反应是限制药物剂量或使用的直接原因。研究发现，在多种肿瘤细胞(如卵巢癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌等)膜表面上的叶酸受体活性和数量显著高于一般正常细胞，这为叶酸受体介导药物靶向于肿瘤细胞的研究奠定了基础〔1〕。　　中药砒霜（三氧化二砷）是中药中的传统毒药，近年来有关其抗肿瘤作用，尤其是在我国率先开展的三氧化二砷治疗急性早幼粒细

5、胞性白血病(APL)的研究引起了人们的广泛兴趣；研究已发现砒霜能显著抑制人肺癌的细胞生长并诱导其凋亡〔2〕。但是,在治疗过程中的严重毒副作用是影响其抗癌疗效的主要原因。本实验以传统中药砒霜为治疗药物，将其包裹在用叶酸偶联白蛋白制成的纳米粒中，并进行其对靶细胞杀伤作用的研究。为以后制备其它抗癌药靶向制剂作铺垫。　　1材料人肺癌细胞株A549（购于武汉大学生命科学院中国典型培养物保藏中心）；人骨髓间充质干细胞；分离自正常人骨髓血（骨髓血样由南昌大学医学院一附院血液科提供）；牛血清白蛋白（上海新量化工试剂有限公司）；叶酸（

6、上海新量化工试剂有限公司）；1-乙基-3-（3-二甲氨丙基）碳二亚胺盐酸盐（简称EDC·HCl）（上海三杰生物技术有限公司）；SephadexG-25（Pharmacia）；三氧化二砷（购自上海化学试剂采购供应站，CP）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；RPMI1640培养基（Gibco）；胰蛋白酶1∶250（Amresco）。　　2方法和结果　　2.1叶酸偶联白蛋白的合成　　2.1.1叶酸偶联白蛋白的合成与分离　　将叶酸溶于pH7.4的磷酸缓冲液(PBS)中，加入EDC·HCl后搅拌活化5min，再加入

7、50mg/ml牛血清白蛋白的PBS溶液，搅拌下反应数小时即得〔3〕。将反应液过SephadexG-25柱，收集前段淡黄色有乳光部分〔4〕。　　2.1.2因素和水平的确定　　经过查阅相关文献资料和大量的预实验最终确定叶酸用量、EDC·HCl与叶酸摩尔比、反应时间3因素各取3水平优化工艺。见表1。表1因素水平（略）　　2.1.3评价指标的选取与测定　　叶酸与牛血清白蛋白偶联越多，纳米粒对肿瘤的靶向性就越高。因此选择叶酸与牛血清白蛋白偶联率作为评价指标。偶联率的测定，将叶酸偶联白蛋白溶于pH7.4的PBS中，用2.5%的胰

8、蛋白酶消化2h后离心取上清液于358nm处测紫外吸收。标准曲线法定量，计算偶联率。偶联率=被偶联的叶酸量/μg被偶联的牛血清白蛋白量/mg　　2.1.4正交实验结果　　按正交设计表L9(34)进行实验，计算偶联率（见表2），方差分析结果见表3。表2正交设计（略）表3方差分析表（略）X1，X2和X3分别是各因素水平1、水平2、水平3偶联率之和；△