应用基因芯片技术筛选卵巢癌紫杉醇耐药差异表达基因

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1、应用基因芯片技术筛选卵巢癌紫杉醇耐药差异表达基因作者：张文晶,李红霞,宋磊,张素梅【摘要】　　目的应用基因芯片技术研究人卵巢癌紫杉醇耐药细胞株OC3/Tax300与其亲本细胞OC3(敏感株)之间的基因表达谱差异，筛选耐药相关基因，探讨基因表达谱差异与卵巢癌肿瘤耐药之间相关性。方法分别提取C3/Tax300与OC3细胞的总RNA并纯化mRNA；将等量的mRNA逆转录，以Cy5和Cy3标记的cDNA做探针，在BiostarH140S基因表达谱芯片上进行杂交。扫描芯片荧光信号图像，用基因图像分析软件对扫描图像进行数字化处理和分析。结果共筛选出显著表达差异基因134条，其中117种基因表达水

2、平下调，17种基因表达上调，主要涉及细胞信号蛋白和传递蛋白，蛋白翻译合成类以及细胞骨架和运动、离子通道和运输蛋白、代谢、发育等14大类相关基因。下调基因主要为EBNA3、COP9、StIP1，上调的基因主要是JAK2、HSPS、NADH等。结论这些基因表达差异与卵巢癌化疗耐药有关。【关键词】基因芯片　卵巢癌　耐药相关基因　　ScreeningDifferentialExpressionofTaxolresistanceRelatedGeneofOvarianCarcinnomabycDNAMicroarray　　Abstract：ObjectiveTostudythegenedi

3、fferentialexpressionoftaxolresistancecelllineOC3/Tax300ofovariancarcinnomaparedicroarray,anddiscusstherEiationshipbetequalquantitymRNAderivedfromOC3/Tax300andOC3ixedprobeageechnismsofdrug-resistanceofovariancancer.　　Keyicroarray;Ovariancancer;Drug-resistance-relatedgene　　0引言　　由于早期诊断困难和化疗耐药，卵巢癌在

4、妇科恶性肿瘤中死亡率占第一位。卵巢癌的发生、发展与多种基因的突变、失活、表达异常有关，研究常规化疗药物作用下相关基因水平改变，寻找新的耐药相关基因，对探讨卵巢癌化疗耐药机制将起重要的作用。本课题应用基因芯片技术研究卵巢癌紫杉醇耐药细胞株OC3/Tax300与其亲本细胞OC3(敏感株)之间的基因表达谱差异，筛选耐药相关基因，探讨卵巢癌肿瘤耐药机制。　　1材料与方法　　本课题所用卵巢癌耐药细胞模型OC3/Tax300为本实验室自建，具体方法和鉴定结果另文发表[1]。其亲本细胞OC3（敏感株）为军事医学科学院李春海教授所赠。基因表达谱芯片BiostarH140S由上海博星基因芯片有限责任公

5、司提供。试剂：TRIzol，异丙醇，氯仿，75%乙醇，MilliQ水（Rnasefree），无水乙醇，杂交试剂盒。方法：分别取OC3与OC3/Tax300细胞，加适量TRLzol匀浆，离心10min取上清液加入氯仿，震荡后放置3min，向上清液中加异丙醇充分混匀再离心10min，加入两次75%乙醇离心弃上清，加入MilliQ水（Rnasefree）完全溶解RNA沉淀，-80℃保存。经预杂交后加入逆转录引物合成cDNA，以Cy5标记耐药细胞，Cy3标记敏感细胞cDNA做探针，纯化后在BiostarH140S基因表达谱芯片上进行杂交。冲洗玻片晾干后以扫描仪ScanArray400

6、0扫描芯片荧光信号图像，用基因图像分析软件GerePix3.0对扫描图像进行数字化处理和分析。　　2结果　　2.1总RNA提取结果耐药细胞及敏感细胞株D260/280值为2.0，电泳可见清析28S、18S条带,见图1。　　图1OC3/Tax300和OC3总RNA结果（略）　　2.2芯片杂交信号散点图用Cy3和Cy5的荧光信号值作散点图，见图2。　　图2Cy3和Cy5的荧光杂交结果（略）　　2.3基因芯片筛选结果见图3。本课题所选两张基因表达芯片，它含有与细胞周期、细胞激素、细胞能量代谢、受体、信号转导、转录因子等相关的14000条cDNA。与敏感细胞相比，有134种基因表达有显著性差

7、异。有17种基因在耐药细胞中表达水平上调（其荧光强度增强）>3倍，有117种表达下调（其荧光强度减弱）<0.33。对这两张芯片基因表达的特异性进行综合分析和判断，对这些基因功能进行分类，涉及癌基因、DNA合成、修复、细胞信号和传递蛋白、蛋白翻译合成类以及细胞骨架和运动、离子通道和运输蛋白、代谢、发育相关等14类基因。见表1。我们发现细胞信号和传递蛋白EBNA3、COP9、StIP1表达明显下调，表达上调的基因占小部分，有代表性的是JAK2、H