不同培养基成分对金铁锁愈伤组织生长及皂苷含量积累的影响

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1、不同培养基成分对金铁锁愈伤组织生长及皂苷含量积累的影响【关键词】金铁锁；愈伤组织；皂苷含量；培养基成分　　金铁锁PsammosileunicoidesS固体培养基（2,4-D0.5mg·L-1+NAA0.5mg·L-1+KT0.1m·L-1+3%蔗糖+0.8%琼脂，pH5.8），(25±1)℃下暗培养。外植体接种6d左右，切口处开始膨胀；10d左右开始长出乳白色愈伤组织；20d左右愈伤组织逐渐覆盖外植体，在25d时挑选质地松散、生长良好的愈伤组织，称重后继代培养，25d后收获称重。　　2.2金铁锁愈伤组织测量指标　　干重增量=最终收获干重

2、－接种干重量　　金铁锁皂苷产量=干重增量×金铁锁皂苷含量　　鲜重称量：从培养瓶中取出愈伤组织，用滤纸吸净其表面水分后称重。干重称量：将收获的愈伤组织置于50℃下干燥至恒重。实验重复3次取平均值。　　2.3金铁锁皂苷含量测定　　2.3.1金铁锁皂苷的提取将获得的愈伤组织干燥粉碎并准确称取2.00g，加入20倍量80%乙醇超声波（频率：40kHz,功率：500in，过滤得醇提液，挥干试剂得醇提物。将此醇提物用适量水溶解，用正丁醇（4∶3∶3）萃取3次。正丁醇萃取液蒸发至干，用甲醇溶解并定容至10ml，得金铁锁皂苷提取液。　　2.3.2金铁锁皂

3、苷含量的测定目前国内尚无金铁锁皂苷类成分的法定对照品，本实验选择人参皂苷Re为对照品，采用香草醛-高氯酸比色法测定金铁锁总苷含量。　　对照品溶液的制备：精密称取人参皂苷Re标准品5mg，加甲醇10ml，振荡，摇匀，待用。　　标准曲线的绘制：分别吸取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7ml人参皂苷Re对照液置于具塞试管中，水浴挥干试剂，加入5%香草醛-高氯酸溶液0.2ml和高氯酸0.8ml，65℃下水浴20min,立即用冰水冷却至常温，加入5ml冰醋酸，摇匀静置后于λ=540nm下测定吸光度，以样品浓度为横坐标，吸光度纵坐

4、标，绘制标准曲线。以此方法得回归方程为：A=1.6283C-0.0023，r=0.9991。　　金铁锁皂苷含量测定：精取金铁锁皂苷提取液0.5ml，置于具塞试管中，按标准曲线操作。用回归方程计算金铁锁皂苷的含量，折算成愈伤组织中的含量和每升培养基的产量。　　3.3氮源对金铁锁愈伤组织生长和皂苷含量积累的影响由表2可知，KNO3与NH4NO3混合添加的时候，干重增量达到最高，皂苷含量积累也呈现较优状态。单独加KNO3作用效果不明显，单独加NH4NO3作用效果较好并随浓度增加而增大。综合分析，混合氮源利于金铁锁愈伤组织生长和皂苷的积累，KNO

5、3∶NH4NO3为（1.9∶1.65）g·L-1时效果最佳。表2氮源对金铁锁愈伤组织生长及皂苷含量积累的影响（略）　　3.4不同浓度磷酸盐对金铁锁愈伤组织生长及皂苷积累的影响由图2可知，在KH2PO4小于1.00mmol·L-1时，金铁锁愈伤组织干重增量和金铁锁皂苷产量增加迅速，在1.00mmol·L-1时两者达到最高，并随着浓度增加而减小。因此，KH2PO4浓度为1mmol·L-1时为愈伤组织生长和金铁锁皂苷合成的最佳浓度。　　3.5钙盐对金铁锁愈伤组织生长及皂苷积累的影响由图3可知，愈伤组织干重增量随着CaCl2浓度的增加而增大，在浓

6、度为4.5mmol·L-1时达到最大，大于4.5mmol·L-1时随着浓度增加而减少。皂苷量在CaCl2浓度为3mmol·L-1之前增加迅速，在3～4.5mmol·L-1时相差不大，均处于较优状态，大于4.5mmol·L-1时随浓度增加而减少。综合考虑，CaCl2浓度为4.5mmol·L-1时为最佳浓度。　　4讨论　　培养基成分对愈伤组织的生长及次生代谢产物的积累具有重要影响。碳源是细胞生长的能量及构成细胞骨架的重要成分，培养基中糖类不仅起到碳源作用，还可以调节细胞渗透压，其种类及浓度对细胞生长及次生代谢产物的积累影响显著［7］。研究表明

7、，金铁锁愈伤组织培养中蔗糖为最佳碳源，其中4%的蔗糖浓度最有利于细胞生长及皂苷物质的积累。同等条件下，蔗糖培养的愈伤组织干重增量及皂苷产量均明显高于葡萄糖和麦芽糖，可能是蔗糖作为两分子糖比单一葡萄糖作用要更为全面。同时发现蔗糖和白砂糖的作用效果较为相似，进行规模化生产开发金铁锁时可选用白砂糖为碳源，以降低生产成本。氮是细胞核酸及生物体内酶的重要组成成分，主要以氨态氮（NH4+）和硝态氮（NO3-）两种形式存在，在植物体内先转化为氨基酸在转化为蛋白质后被植物吸收利用。其种类及浓度对细胞生长及次生产物合成具有显著效果［8］。本实验研究发现，单

8、独使用NH4NO3或两者混合使用效果均优于单独使用KNO3，说明混合氮源利于金铁锁愈伤组织细胞生长及皂苷产物的合成，KNO3∶NH4NO3的最优质量比值为1.9∶1.65g·L-1。磷元素在生