不同培养基成分对金铁锁愈伤组织生长及皂苷含量积累

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1、不同培养基成分对金铁锁愈伤组织生长及皂苷含量积累【摘要】　　目的研究不同培养基成分对金铁锁愈伤组织生长和皂苷积累规律的影响。方法改变培养基中碳源、氮源、磷酸盐、钙盐的浓度，比色法测定愈伤组织中皂苷的含量。结果金铁锁愈伤组织生长和皂苷积累的最适培养基成分为蔗糖40g·L-1，KNO3∶NH4NO3为（1.9：1.65）g·L-1，1mmol·L-1KH2PO4，4.5mmol·L-1CaCl2。结论蔗糖作为碳源最有利于金铁锁愈伤组织生物量的积累和金铁锁皂苷的生物合成。混合氮源有利于金铁锁愈伤组织生长和皂苷

2、含量的积累。【关键词】金铁锁；愈伤组织；皂苷含量；培养基成分　　金铁锁PsammosileunicoidesS固体培养基（2,4-D0.5mg·L-1+NAA0.5mg·L-1+KT0.1m·L-1+3%蔗糖+0.8%琼脂，pH5.8），(25±1)℃下暗培养。外植体接种6d左右，切口处开始膨胀；10d左右开始长出乳白色愈伤组织；20d左右愈伤组织逐渐覆盖外植体，在25d时挑选质地松散、生长良好的愈伤组织，称重后继代培养，25d后收获称重。　　2.2金铁锁愈伤组织测量指标　　干重增量=最终收获干重－接种

3、干重量　　金铁锁皂苷产量=干重增量×金铁锁皂苷含量　　鲜重称量：从培养瓶中取出愈伤组织，用滤纸吸净其表面水分后称重。干重称量：将收获的愈伤组织置于50℃下干燥至恒重。实验重复3次取平均值。　　2.3金铁锁皂苷含量测定　　2.3.1金铁锁皂苷的提取将获得的愈伤组织干燥粉碎并准确称取2.00g，加入20倍量80%乙醇超声波（频率：40kHz,功率：500in，过滤得醇提液，挥干试剂得醇提物。将此醇提物用适量水溶解，用正丁醇（4∶3∶3）萃取3次。正丁醇萃取液蒸发至干，用甲醇溶解并定容至10ml，得金铁锁皂苷

4、提取液。　　2.3.2金铁锁皂苷含量的测定目前国内尚无金铁锁皂苷类成分的法定对照品，本实验选择人参皂苷Re为对照品，采用香草醛-高氯酸比色法测定金铁锁总苷含量。　　对照品溶液的制备：精密称取人参皂苷Re标准品5mg，加甲醇10ml，振荡，摇匀，待用。　　标准曲线的绘制：分别吸取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7ml人参皂苷Re对照液置于具塞试管中，水浴挥干试剂，加入5%香草醛-高氯酸溶液0.2ml和高氯酸0.8ml，65℃下水浴20min,立即用冰水冷却至常温，加入5ml冰醋酸，摇匀

5、静置后于λ=540nm下测定吸光度，以样品浓度为横坐标，吸光度纵坐标，绘制标准曲线。以此方法得回归方程为：A=1.6283C-0.0023，r=0.9991。　　金铁锁皂苷含量测定：精取金铁锁皂苷提取液0.5ml，置于具塞试管中，按标准曲线操作。用回归方程计算金铁锁皂苷的含量，折算成愈伤组织中的含量和每升培养基的产量。　　3结果　　3.1不同碳源对金铁锁愈伤组织生长及皂苷含量积累的影响由表1可知，蔗糖作为碳源对金铁锁愈伤组织的生长及皂苷积累影响作用最为显著。白砂糖影响效果次于蔗糖，但明显高于麦芽糖和葡萄

6、糖。表1不同碳源对金铁锁愈伤组织生长及皂苷含量积累的影响（略）　　3.2不同蔗糖浓度对金铁锁愈伤组织生长和皂苷含量积累的影响由图1知，干重增量和皂苷产量均随蔗糖浓度增加而增大,在蔗糖40～50g·L-1的时候达到最高,随后随浓度增大而迅速降低。综合分析，以蔗糖40g·L-1为最优碳源浓度。　　3.3氮源对金铁锁愈伤组织生长和皂苷含量积累的影响由表2可知，KNO3与NH4NO3混合添加的时候，干重增量达到最高，皂苷含量积累也呈现较优状态。单独加KNO3作用效果不明显，单独加NH4NO3作用效果较好并随浓度

7、增加而增大。综合分析，混合氮源利于金铁锁愈伤组织生长和皂苷的积累，KNO3∶NH4NO3为（1.9∶1.65）g·L-1时效果最佳。表2氮源对金铁锁愈伤组织生长及皂苷含量积累的影响（略）　　3.4不同浓度磷酸盐对金铁锁愈伤组织生长及皂苷积累的影响由图2可知，在KH2PO4小于1.00mmol·L-1时，金铁锁愈伤组织干重增量和金铁锁皂苷产量增加迅速，在1.00mmol·L-1时两者达到最高，并随着浓度增加而减小。因此，KH2PO4浓度为1mmol·L-1时为愈伤组织生长和金铁锁皂苷合成的最佳浓度。　　3

8、.5钙盐对金铁锁愈伤组织生长及皂苷积累的影响由图3可知，愈伤组织干重增量随着CaCl2浓度的增加而增大，在浓度为4.5mmol·L-1时达到最大，大于4.5mmol·L-1时随着浓度增加而减少。皂苷量在CaCl2浓度为3mmol·L-1之前增加迅速，在3～4.5mmol·L-1时相差不大，均处于较优状态，大于4.5mmol·L-1时随浓度增加而减少。综合考虑，CaCl2浓度为4.5mmol·L-1时为最佳浓度。　　4讨论　　培养基成分对愈伤