重组人生长激素在体外对人胃癌细胞作用的研究

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1、重组人生长激素在体外对人胃癌细胞作用的研究【摘要】目的:研究重组人生长激素(rhGH)在体外对胃癌细胞生长的影响。方法:设对照组、rhGH组、5氟尿嘧啶（5FU）组和rhGH加5FU组共4组，依rhGH浓度不同，rhGH和rhGH加5FU组又各分4个亚组。利用体外细胞培养、MTT比色、流式细胞仪及免疫细胞化学等方法,测定不同浓度的rhGH对人胃癌细胞株MGC803肿瘤抑制率、细胞周期、细胞增殖指数（PI）及核增殖抗原Ki67表达的影响。结果:rhGH在体外无明显促进MGC803细胞分裂增殖作用；对照组与各rhGH组比较，肿瘤抑制率、PI、Ki67表达强度差异均无显著

2、性(P>0.05)；rhGH各亚组间比较差异亦无显著性；5FU组与rhGH组及对照组比较，各rhGH加5FU组与rhGH组及对照组比较细胞抑制率增加,阻滞于G0～G1期的细胞数增加，S期细胞明显减少，PI明显降低(P<0.05)，Ki67表达强度明显下降。结论:重组人生长激素在体外不会促进胃癌细胞的增殖。【关键词】胃癌；细胞周期；核增殖抗原；生长激素，人　生长激素（groone,GH）具有直接的代谢调理作用，能促进蛋白质合成，增加脂肪氧化分解和糖异生，提高糖利用及营养物质转换率，同时提高1,25(OH)2VitD3水平，增加肠道对钙和磷的吸收。近年来，重组人

3、生长激素（rebinanthumangroone,rhGH）已经在改善高分解代谢状态患者的营养状况、纠正负氮平衡、促进伤口愈合及提高手术耐受性等方面得到广泛应用。GH纠正负氮平衡及调节免疫的作用，可用于晚期肿瘤患者以逆转其恶液质状态，但GH可能的促肿瘤细胞增殖作用限制了其在肿瘤患者中的应用。本实验旨在通过体外细胞培养观察rhGH对人低分化胃黏液腺癌细胞MGC803生长的影响，为rhGH能否用于临床胃癌患者提供实验基础。　　1材料与方法　　1.1主要试剂及仪器rhGH（瑞士雪兰诺大药厂馈赠的思真，Saizen），5氟尿嘧啶（5FU，南通精华制药厂），RPMI1640(美国GI

4、BCO公司)，小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，四甲基偶氮唑蓝（MTT，Amresco公司)，二甲基亚砜(DMSO，Sigma公司)，酶联免疫检测仪（BIORAD550），流式细胞仪(FACScalibur型，美国BD公司)，一抗Ki67、即用型SP免疫组化试剂盒及DAB显色剂（北京中杉金桥生物技术公司），人低分化胃黏液腺癌细胞株MGC803（解放军八一医院全军肿瘤中心）。　　1.2实验分组本实验设对照组（等体积RPMI1640）、5FU组（5FU10mg·L-1）、rhGH组和rhGH加5FU组共4组，后两组根据rhGH浓度不同又分为1～44个亚组，rhG

5、H浓度依次为50、100、200及400ng·ml-1。　　1.3细胞培养MGC803细胞在含10%小牛血清的RPMI1640完全培养液(含青霉素100U·ml-1,链霉素100U·ml-1)中，于37℃、5%CO2的培养箱中培养。取对数生长期细胞用0.25%胰蛋白酶消化，用4g·L-1台盼蓝染色后计算细胞存活率，并行细胞计数，调整细胞悬液浓度至1×105ml-1备用。　　1.4MTT比色法检测癌细胞活性将单细胞悬液接种于96孔板，200μl·孔-1，每组设4个复孔。24h细胞完全贴壁后吸出各孔培养液，加入受试药物，置于培养箱中培养48h以检测各组细胞抑制率，另用同样方法培养0

6、、24、48、72h以绘制细胞生长曲线。实验终止前4h加入MTT液20μl·孔-1（终浓度为5mg·ml-1），实验结束后倾去药液及培养液，每孔加入150μlDMSO，平板震荡仪震荡10min，用酶联免疫检测仪于570nm波长处测定各孔光密度（OD）值，然后按下式计算细胞抑制率和生长率：抑制率=(1－实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100%；生存率=实验组平均OD值/对照组平均OD值×100%。　　1.5流式细胞仪检测各组细胞周期及细胞增殖指数（PI）各组细胞培养24h后消化、离心，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤2次，获取1×106ml-1以上的细胞，将收集标本荧光素(碘化

7、丙锭)染色20min，用激发波长为488nm、接受波长为575nm的流式细胞仪进行细胞周期分析。根据细胞周期分析结果，按下式计算PI：PI=（S期细胞＋G2～M期细胞）/(G0～G1期细胞＋S期细胞＋G2～M期细胞)×100％。　　1.6免疫细胞化学检测各组细胞核增殖抗原Ki67的表达在24孔板中进行细胞爬片，加入各组受试药物，培养48h后取出玻片。冷丙酮固定10min后，采用链霉素抗生物素蛋白过氧化物连接(SP)免疫细胞化学方法进行染色，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片。Ki67以