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时间:2018-05-04
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1、重组人生长激素在体外对人胃癌细胞作用的研究【摘要】目的:研究重组人生长激素(rhGH)在体外对胃癌细胞生长的影响。方法:设对照组、rhGH组、5氟尿嘧啶(5FU)组和rhGH加5FU组共4组,依rhGH浓度不同,rhGH和rhGH加5FU组又各分4个亚组。利用体外细胞培养、MTT比色、流式细胞仪及免疫细胞化学等方法,测定不同浓度的rhGH对人胃癌细胞株MGC803肿瘤抑制率、细胞周期、细胞增殖指数(PI)及核增殖抗原Ki67表达的影响。结果:rhGH在体外无明显促进MGC803细胞分裂增殖作用;对照组与各rhGH组比较,肿瘤抑制率、PI、Ki67表达强度差异均无显著
2、性(P>0.05);rhGH各亚组间比较差异亦无显著性;5FU组与rhGH组及对照组比较,各rhGH加5FU组与rhGH组及对照组比较细胞抑制率增加,阻滞于G0~G1期的细胞数增加,S期细胞明显减少,PI明显降低(P<0.05),Ki67表达强度明显下降。结论:重组人生长激素在体外不会促进胃癌细胞的增殖。【关键词】胃癌;细胞周期;核增殖抗原;生长激素,人 生长激素(groone,GH)具有直接的代谢调理作用,能促进蛋白质合成,增加脂肪氧化分解和糖异生,提高糖利用及营养物质转换率,同时提高1,25(OH)2VitD3水平,增加肠道对钙和磷的吸收。近年来,重组人
3、生长激素(rebinanthumangroone,rhGH)已经在改善高分解代谢状态患者的营养状况、纠正负氮平衡、促进伤口愈合及提高手术耐受性等方面得到广泛应用。GH纠正负氮平衡及调节免疫的作用,可用于晚期肿瘤患者以逆转其恶液质状态,但GH可能的促肿瘤细胞增殖作用限制了其在肿瘤患者中的应用。本实验旨在通过体外细胞培养观察rhGH对人低分化胃黏液腺癌细胞MGC803生长的影响,为rhGH能否用于临床胃癌患者提供实验基础。 1材料与方法 1.1主要试剂及仪器rhGH(瑞士雪兰诺大药厂馈赠的思真,Saizen),5氟尿嘧啶(5FU,南通精华制药厂),RPMI1640(美国GI
4、BCO公司),小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司),四甲基偶氮唑蓝(MTT,Amresco公司),二甲基亚砜(DMSO,Sigma公司),酶联免疫检测仪(BIORAD550),流式细胞仪(FACScalibur型,美国BD公司),一抗Ki67、即用型SP免疫组化试剂盒及DAB显色剂(北京中杉金桥生物技术公司),人低分化胃黏液腺癌细胞株MGC803(解放军八一医院全军肿瘤中心)。 1.2实验分组本实验设对照组(等体积RPMI1640)、5FU组(5FU10mg·L-1)、rhGH组和rhGH加5FU组共4组,后两组根据rhGH浓度不同又分为1~44个亚组,rhG
5、H浓度依次为50、100、200及400ng·ml-1。 1.3细胞培养MGC803细胞在含10%小牛血清的RPMI1640完全培养液(含青霉素100U·ml-1,链霉素100U·ml-1)中,于37℃、5%CO2的培养箱中培养。取对数生长期细胞用0.25%胰蛋白酶消化,用4g·L-1台盼蓝染色后计算细胞存活率,并行细胞计数,调整细胞悬液浓度至1×105ml-1备用。 1.4MTT比色法检测癌细胞活性将单细胞悬液接种于96孔板,200μl·孔-1,每组设4个复孔。24h细胞完全贴壁后吸出各孔培养液,加入受试药物,置于培养箱中培养48h以检测各组细胞抑制率,另用同样方法培养0
6、、24、48、72h以绘制细胞生长曲线。实验终止前4h加入MTT液20μl·孔-1(终浓度为5mg·ml-1),实验结束后倾去药液及培养液,每孔加入150μlDMSO,平板震荡仪震荡10min,用酶联免疫检测仪于570nm波长处测定各孔光密度(OD)值,然后按下式计算细胞抑制率和生长率:抑制率=(1-实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100%;生存率=实验组平均OD值/对照组平均OD值×100%。 1.5流式细胞仪检测各组细胞周期及细胞增殖指数(PI)各组细胞培养24h后消化、离心,用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次,获取1×106ml-1以上的细胞,将收集标本荧光素(碘化
7、丙锭)染色20min,用激发波长为488nm、接受波长为575nm的流式细胞仪进行细胞周期分析。根据细胞周期分析结果,按下式计算PI:PI=(S期细胞+G2~M期细胞)/(G0~G1期细胞+S期细胞+G2~M期细胞)×100%。 1.6免疫细胞化学检测各组细胞核增殖抗原Ki67的表达在24孔板中进行细胞爬片,加入各组受试药物,培养48h后取出玻片。冷丙酮固定10min后,采用链霉素抗生物素蛋白过氧化物连接(SP)免疫细胞化学方法进行染色,DAB显色,苏木素复染,中性树胶封片。Ki67以
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