血管生成素-1在体外对人胃癌细胞生物学作用的研究.doc

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1、血管生成素-1在体外对人胃癌细胞生物学作用的研究【摘要】目的：探讨人血管生成素-1(Ang1)及其与血管内皮生长因子165(VEGF165）共同作用对人胃癌细胞的生物学作用,研究其在肿瘤发生中的作用机制。方法：应用复制缺陷型腺病毒（Ad）-绿色荧光蛋白（GFP）、Ad-Ang1、Ad-VEGF165和Ad-Ang1+Ad-VEGF165/2转染人胃癌细胞株MGC-803，使用MTT比色法分析它们对胃癌细胞增殖的影响；通过流式细胞仪分析血浆饥饿时其对凋亡的影响；使用免疫细胞化学法检测Ki-67的表达；应用RT-PCR方法半

2、定量检测bcl-2mRNA、baxmRNA的表达情况。结果：MTT结果显示24、48和72hAd-Ang1转染组、Ad-VEGF165转染组和Ad-Ang1+Ad-VEGF165/2转染组吸光度均明显高于Ad-GFP组及对照组(P<0.05)；Ad-GFP组与对照组相比无显著差异(P>0.05)；Ad-Ang1+Ad-VEGF165/2转染组吸光度明显高于Ad-Ang1转染组和Ad-VEGF165转染组(P<0.05)。流式细胞仪检测结果显示Ad-Ang1、Ad-VEGF165及Ad-Ang1+Ad-V

3、EGF165/2处理组与对照组及空转染组相比均能够显著抑制细胞凋亡(P<0.01)。免疫细胞化学法显示各转染组Ki-67表达强度均显著高于对照组和Ad-GFP组(P<0.01)。RT-PCR结果显示bcl-2mRNA在各转染组中的表达要明显高于对照组(P<0.05)；baxmRNA在各转染组中的表达要明显低于对照组(P<0.05)。结论：Ang1、VEGF165和Ang1+VEGF165/2能够明显促进人胃癌细胞MGC-803增殖，抑制血浆饥饿时的凋亡，Ang1+VEGF165/2组的作用要显著强

4、于Ang1组和VEGF165组。【关键词】血管生成素-1；血管内皮生长因子165；Ki-67；胃癌；增殖；凋亡血管生成素1（angiopoietin-1,Ang1）被发现在肿瘤的转移、血管生成和肿瘤的侵袭中发挥重要作用，目前研究较多集中于其对肿瘤血管生成的作用上。Ang1是否能够对肿瘤细胞产生作用，以及Ang1和血管内皮生长因子165（VEGF165）是否能够协同作用于肿瘤细胞，目前并无相关研究。本实验以腺病毒为载体，将Ang1、VEGF165转染至人胃癌细胞株MGC-803，研究其对胃癌细胞株体外增殖和凋亡的影响。1材

5、料和方法1.1材料人胃腺癌细胞株MGC-803购自中国科学院，复制缺陷型腺病毒（Ad）重组体Ad-Ang1、Ad-VEGF165及对照病毒Ad-绿色荧光蛋白（GFP）由南京医科大学第一附属医院构建并赠送，AnnexinⅤ-FITC/PI试剂盒购自BenderMedsystems公司。1.2方法71.2.1细胞培养MGC-803细胞用含有10％胎牛血清的1640培养液于37℃、5%CO2的培养箱中培养，培养基中含100U·ml-1青霉素和链霉素。1.2.2MTT法测定Ad-Ang1、Ad-VEGF165以及Ad-Ang1+

6、Ad-VEGF165/2对MGC-803细胞增殖的影响实验分对照组(正常细胞组)、Ad-GFP组(平行对照组)、Ad-Ang1组(Ang1转染组)、Ad-VEGF165组(VEGF165转染组)、Ad-Ang1+Ad-VEGF165/2组(Ang1、VEGF165联合转染组)5组，每组设3个复孔。取对数生长期的MGC-803细胞，以8000个·孔-1接种细胞于96孔培养板中，细胞生长度达60%～70%时对Ad-GFP、Ad-Ang1和Ad-VEGF165等3组予相应的无血清无抗生素培养液稀释的病毒液100μl感染，Ad-

7、Ang1+Ad-VEGF165/2组加入相应的无血清无抗生素培养液稀释的病毒液50μl感染，感染8h后换RPMI1640完全培养液继续培养，对照组加入无血清的RPMI1640培养液。分别于感染后24、48、72h测定每孔吸光度(A值)，以空白对照孔的A值调零。1.2.3流式细胞仪检测转染Ang1、VEGF165、Ang1+VEGF165/2对MGC-803凋亡的影响将MGC-803以1.0×105个·孔-1接种于6孔板，实验分组同“1.2.2”，每组设3个复孔。感染8h后用无血清培养液继续培养48h后收集对照组、Ad-G

8、FP组、Ad-Ang1组、Ad-VEGF165组和Ad-Ang1+Ad-VEGF165/2组的MGC-803细胞，1000r·min-14℃离心10min，弃上清，加入1ml冷的PBS，轻轻震荡使细胞悬浮，1000r·min-14℃离心10min，弃上清，重复用冷的PBS洗两次。将细胞重悬于200μl结合缓冲液，加入