重组人生长激素在体外对人胃癌细胞作用的研究_1

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1、重组人生长激素在体外对人胃癌细胞作用的研究【摘要】目的:研究重组人生长激素(rhGH)在体外对胃癌细胞生长的影响。方法:设对照组、rhGH组、5氟尿嘧啶组和rhGH加5FU组共4组，依rhGH浓度不同，rhGH和rhGH加5FU组又各分4个亚组。利用体外细胞培养、MTT比色、流式细胞仪及免疫细胞化学等方法,测定不同浓度的rhGH对人胃癌细胞株MGC803肿瘤抑制率、细胞周期、细胞增殖指数及核增殖抗原Ki67表达的影响。结果:rhGH在体外无明显促进MGC803细胞分裂增殖作用；对照组与各rhGH组比较，肿瘤抑制率、PI、Ki67表达强度差异均无显著性

2、(P>)；rhGH各亚组间比较差异亦无显著性；5FU组与rhGH组及对照组比较，各rhGH加5FU组与rhGH组及对照组比较细胞抑制率增加,阻滞于G0～G1期的细胞数增加，S期细胞明显减少，PI明显降低(P【关键词】胃癌；细胞周期；核增殖抗原；生长激素，人生长激素具有直接的代谢调理作用，能促进蛋白质合成，增加脂肪氧化分解和糖异生，提高糖利用及营养物质转换率，同时提高1,25(OH)2VitD3水平，增加肠道对钙和磷的吸收。近年来，重组人生长激素已经在改善高分解代谢状态患者的营养状况、纠正负氮平衡、促进伤口愈合及提高手术耐受性等方面得到广泛应用。GH纠正负

3、氮平衡及调节免疫的作用，可用于晚期肿瘤患者以逆转其恶液质状态，但GH可能的促肿瘤细胞增殖作用限制了其在肿瘤患者中的应用。本实验旨在通过体外细胞培养观察rhGH对人低分化胃黏液腺癌细胞MGC803生长的影响，为rhGH能否用于临床胃癌患者提供实验基础。1材料与方法主要试剂及仪器rhGH，5氟尿嘧啶，RPMI1640(美国GIBCO公司)，小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，四甲基偶氮唑蓝，流式细胞仪(FACScalibur型，美国BD公司)，一抗Ki67、即用型SP免疫组化试剂盒及DAB显色剂，人低分化胃黏液腺癌细胞株MGC803。实验分组本实验设对

4、照组、5FU组、rhGH组和rhGH加5FU组共4组，后两组根据rhGH浓度不同又分为1～4个亚组，rhGH浓度依次为50、100、200及400ng·ml-1。细胞培养MGC803细胞在含10%小牛血清的RPMI1640完全培养液(含青霉素100U·ml-1,链霉素100U·ml-1)中，于37℃、5%CO2的培养箱中培养。取对数生长期细胞用%胰蛋白酶消化，用g·L-1台盼蓝染色后计算细胞存活率，并行细胞计数，调整细胞悬液浓度至1×10ml-1备用。MTT比色法检测癌细胞活性将单细胞悬液接种于96孔板，200μl·孔-1，每组设4个复孔。24h细胞完全贴

5、壁后吸出各孔培养液，加入受试药物，置于培养箱中培养48h以检测各组细胞抑制率，另用同样方法培养0、24、48、72h以绘制细胞生长曲线。实验终止前4h加入MTT液20μl·孔-1，实验结束后倾去药液及培养液，每孔加入150μlDMSO，平板震荡仪震荡10min，用酶联免疫检测仪于570nm波长处测定各孔光密度值，然后按下式计算细胞抑制率和生长率：抑制率=(1－实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100%；生存率=实验组平均OD值/对照组平均OD值×100%。流式细胞仪检测各组细胞周期及细胞增殖指数各组细胞培养24h后消化、离心，用磷酸盐缓冲液洗涤2次，获取1

6、×10ml-1以上的细胞，将收集标本荧光素(碘化丙锭)染色20min，用激发波长为488nm、接受波长为575nm的流式细胞仪进行细胞周期分析。根据细胞周期分析结果，按下式计算PI：PI=/(G0～G1期细胞＋S期细胞＋G2～M期细胞)×100％。免疫细胞化学检测各组细胞核增殖抗原Ki67的表达在24孔板中进行细胞爬片，加入各组受试药物，培养48h后取出玻片。冷丙酮固定10min后，采用链霉素抗生物素蛋白过氧化物连接(SP)免疫细胞化学方法进行染色，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片。Ki67以1∶50稀释。根据阳性细胞着色面积和着色强度积分，应用Ima

7、geproplus图像分析软件进行分析，每组选取10个高倍镜视野，用平均光强度表示Ki67相对表达量。统计学处理所有资料均用SPSS统计软件进行统计学分析，数据用x-±s表示，组间比较采用单因素方差分析。结果.1细胞抑制率及细胞生长曲线.细胞抑制率培养48h所得的实验各组OD值见表1。由表1可见，各rhGH组与对照组、各rhGH加5FU组与5FU组、各rhGH组内及各rhGH加5FU组内比较，细胞抑制率和生存率差异无统计学意义(P>)；各rhGH加5FU组、5FU组分别与对照组比较细胞生长抑制率明显增加，生存率明显下降(P.细胞生长曲线对照组与各

8、rhGH组比较生长曲线无明显变化，各r