叶酸偶联5氟尿嘧啶白蛋白对肿瘤细胞的毒性及靶向性研究

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1、叶酸偶联5氟尿嘧啶白蛋白对肿瘤细胞的毒性及靶向性研究作者：张武雄,凌丽,何练芹,臧林泉,潘雪刁,朱亮【摘要】目的研究叶酸偶联5氟尿嘧啶白蛋白在体外对肿瘤细胞的毒性及经叶酸受体介导的靶向性。方法选用叶酸受体表达阳性FR(+)宫颈癌HeLa细胞及叶酸受体表达阴性FR(-)肺癌A549细胞进行实验。用MTT法观察叶酸偶联物对细胞的毒性作用,同时利用游离叶酸能与叶酸偶联物竞争性结合叶酸受体的原理，考察叶酸偶联物是否具有经叶酸受体介导的靶向性。结果叶酸偶联物对FR(+)HeLa细胞具有比5氟尿嘧啶原料药更高的抑制率,能有效的靶向FR(+)He

2、La细胞,且细胞毒性作用能被过量的外源性游离叶酸所抑制,而叶酸偶联物对FR(-)A549细胞作用很弱。结论叶酸偶联的5氟尿嘧啶白蛋白能经叶酸受体介导靶向于叶酸受体丰富的肿瘤细胞。【关键词】叶酸偶联;5氟尿嘧啶;细胞毒性;靶向性　　Abstract:ObjectiveTostudythecytotoxicityandtargetingabilityoffolateconjugated5fluorouracilalbuminviafolatereceptormediatedendocytosisontumorcellsinvitro

3、.MethodsThefolatereceptorpositiveFR(+)HeLacellandFR()lungA549cellent.ThecytotoxicityofthefolateconjugateontumorcellseasuredbyMTTassay.Accordingtothepetitiveinhibitionprincipleandduetothatfreefolatehadhighaffinityforfolatereceptor,freefolicacidediatedendocytosis.ResultsThe

4、cytotoxicityoffolateconjugatetoFR(+)HeLacelleconcentration,andcouldbeinhibitedbyexcessfreefolicacid,incouldbetargetedintotumorcellsediatedendocytosissignificantly.　　KeyoForma371);SZ93自动双重纯水蒸馏器(上海雅荣生化设备仪器有限公司)。　　1.2实验材料　　宫颈癌HeLa细胞、肺癌A549细胞(本院药理教研室保存);MTT(ThiazolylBlue噻唑兰,S

5、igma分装,北京鼎国生物技术有限责任公司);RPMI1640培养液(吉诺生物医药技术有限公司);RPMIMedium1640无叶酸培养基(CIBCO);特级胎牛血清(天津市濒洋生物制品科技责任有限公司);胰酶(Sigma,北京利科恒达科贸有限公司);96孔培养板(加拿大JETBiochemicalsIntl.，Inc);叶酸(企业标准，上海新量化工试剂有限公司);5氟尿嘧啶(5FU，南通精华制药有限公司);5氟尿嘧啶白蛋白(5FUB，实验室自制);叶酸偶联的5氟尿嘧啶白蛋白(5FUBF，实验室自制),其余试剂均为分析纯

6、。　　2方法与结果　　2.1药物在体外的细胞毒性[10,11]　　实验分5组:空白对照组(不加细胞)、阴性对照组(加细胞,不加药)、5氟尿嘧啶组(5FU,阳性对照组)、5氟尿嘧啶白蛋白组(5FUB,不接叶酸)、叶酸偶联的5氟尿嘧啶白蛋白组(5FUBF,接有叶酸),用含10%(φ)胎牛血清RPMI1640培养液培养细胞,取处于对数生长期、生长状态良好的细胞,用0.25%胰蛋白酶消化单层培养细胞,离心使细胞沉淀,用PBS洗涤,用含10%(φ)胎牛血清无叶酸RPMI1640培养液配成单个细胞悬液,细胞密度为105个/mL以每孔1

7、04个细胞接种于96孔培养板中,每孔100μL。将培养板移入培养箱中,在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下分别培养24h后更换100μL无叶酸RPMI1640培养液,并分别加入5FU,5FUB,5FUBF药液各100μL,使终质量浓度分别为2μg/mL,10μg/mL,50μg/mL的(偶联物均折算成5Fu的等价浓度),再培养36h后,每孔更换为100μL无血清无叶酸RPMI1640培养基的培养基,加入20μLMTT溶液(5mg/mL),在微量振荡器上振荡3min,继续培养4h,弃培养液,孔加入150μLDMSO,酶联免疫检测仪

8、测定490nm吸光度(A)。每种药物浓度设6个复孔。根据抑制率=(1-A药物/A对照)×100%计算抑制率,并以抑制率对药物浓度作图,结果见图1。从图1A中可看出,