外周血psa、psa mrna联合检测在前列腺癌诊断中的临床应用

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1、外周血PSA、PSAmRNA联合检测在前列腺癌诊断中的临床应用作者:辛华 马雷 高英英郭宇航 孙玉鸿 江清林 刘国辉【摘要】目的探讨利用外周血PSA、PSAmRNA联合检测诊断前列腺癌(PCa)的临床应用及意义。方法运用酶联免疫分析和巢式RTPCR检测22例PCa、10例良性前列腺增生(BPH)患者,5例健康男性和5例健康女性外周血中PSA、PSAmRNA的情况。结果 PCa患者血清PSA的水平与临床分期、Gleason评分有关(P<005),而与年龄无关(P>005);外周血PSA、PSAmRNA与临床分期、内分泌治疗有关(P<005),而与年龄、Gle

2、ason评分无关(P<005);22例PCa标本中PSAmRNA阳性表达15例,阳性率68%,10例BPH和10例阴性对照标本无表达。结论利用外周血PSA、PSAmRNA联合检测是一种早期发现PCa微转移,判断其临床变化过程、分期、预计复发和评价疗效的方法。【关键词】前列腺特异抗原;前列腺癌;前列腺增生;逆转录聚合酶链式反应  临床上大约有50%的前列腺癌(PCa)病人在确诊时就已经发生了转移,病变已属晚期,预后不良〔1~3〕。国外报道血清游离PSA与外周血PSAmRNA联合检测PCa在鉴别良、恶疾病上有一定优越性〔4,5〕。国内这方面报道较少。应用RTPCR

3、技术检测外周血中存在的少量癌细胞,可以发现微转移,对肿瘤的复发、转移、预后及临床治疗具有指导意义〔6,7〕。本研究采用酶联免疫技术和巢式RTPCR技术联合检测外周血PSA和PSAmRNA,以提高PCa微转移的诊断效率、监测复发、预测肿瘤分期及预后。  1材料与方法  11病例资料  PCa组:选择2005~2006年佳木斯大学附属第一医院、佳木斯市中心医院门诊和住院病人。22例均为初诊PCa患者,均经前列腺穿刺病理诊断,年龄64~82岁,平均72岁。22例PCa患者中有15例接受了内分泌治疗,7例未接受。BPH组:10例均为行前列腺经尿道电切术后病理证实患者,

4、年龄34~81岁,平均65岁。阴性对照组:5例男性健康志愿者(检测前1个月限制性生活)和5例女性健康志愿者,血液学指标均正常,年龄25~45岁,平均38岁。  12仪器及材料  Ficoll淋巴细胞分离液购自中国医学科学院天津血液病研究所,总RNA提取RNAiso试剂盒、两步法RTPCR试剂盒购自大连生物工程有限公司,引物由上海生物工程服务技术有限公司合成,PSA定量试剂盒购自美国博检生物试剂有限公司。BiometraTgPCR仪:华粤企业集团有限公司;DU800核酸蛋白分析仪:Beckman公司;免疫分析仪器:DNM9602G型酶标分析仪(北京普朗仪器公司)

5、。  13引物序列  PCR引物:(1)外引物:PSA494:5’TACCCACTGCATCAGGAACA3’;PSA960:5’CCTTGAAGCACACCATTACA3’。(2)内引物:PSA559:5’ACACAGGCCAGGTATTTCAG3’;PSA894:5’GTCCAGCGTCCAGCACACAG3’。βactin上游:5’CGGGAAATCGTGCGTGACAT3’;下游:5’GAACTTTGGGGGATGCTCGC3’。扩增目的片段长度为712bp。  14血清的提取  抽取空腹静脉血(各项检查前)5ml,立

6、即2000r/min离心10min,分离血清置-20℃保存,1l静脉血(各项检查前)肝素抗凝,用Ficoll淋巴细胞分离液分离白细胞置-80℃冰箱保存,提取过程按其说明书操作。  16总RNA的抽提及质量鉴定  用Trizal试剂提取总RNA,提取过程按其说明书操作。提取产物用12%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA质量。紫外分光光度计下测OD260、OD280,测定RNA纯度和浓度。取OD260/OD280值在18~20范围内的标本进行逆转录。所有实验中的塑料制品及实验用具均经01%DEPC水处理后高压灭菌。  17RTPCR  取1μg总RNA进

7、行逆转录反应;取逆转录产物2μl和PSA上下游外、内引物各1μl,使用20μl反应体系进行2次PCR(2次PCR反应体系相同),同时扩增PSA、βactin和阴性对照cDNA(由健康女性外周血白细胞RNA逆转录获得)。具体循环参数为:94℃4min,94℃45s,55℃30s,72℃45s;25个循环之后,72℃延伸10min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后用EB染色,经凝胶成像系统拍照。  18血清PSA的检测  PSA定量检测由专人严格按说明书进行操作。  19统计学处理  应用SPSS100软件对数据进行处理,采用t检验、χ2检验。  2结果 

8、 21P

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