吸烟者树突状细胞的功能状态研究分析

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1、吸烟者树突状细胞的功能状态研究分析【摘要】目的研究吸烟者树突状细胞(DC)的功能。方法分离吸烟者和非吸烟者外周血单个核细胞(PBMC)，在含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素4(IL-4)的培养条件下制备DC。流式细胞仪检测DC表面CD86的表达；混合淋巴细胞反应(MLR)检测DC对T淋巴细胞的刺激能力；酶群免疫吸附法(ELISA)测定MLR上清液中细胞因子水平。结果与非吸烟者比较，吸烟者DC表面CD86的表达明显增高，对T淋巴细胞的刺激能力增强；致炎细胞因子(IL-1β)分泌增多，抑炎因子(IL-10)分泌减少。结论吸烟者DC明显激活，可能是吸烟致动脉粥

2、样硬化的机制之一。【关键词】吸烟；树突状细胞；细胞因子；动脉粥样硬化【Abstract】ObjectiveToinvestigatethefunctionofdendriticcells(DCs)insmokingperson.MethodsDCshumanperipherybloodmonocytecells(PBMCs)uponcultureacrophagecolonystimulatingfactor(GM-CSF)fromsmokingperson.Thesurfaceco-stimulatoryfactorCD86(7-2)ofDCsetry.Immunost

3、imulatorycapacityeasuredbymixedlymphocytereaction(MLR).ELISAoreCD86smokingperson.ThestimulatingcapacityofDCsinMLRphocytesinMLRproducedhigherlevelsofpro-inflammationcytokinesandlomationcytokines，paredalgroup.ConclusionDCsofsmokingpersonareactivated，ayplayanimportantroleintheprogressofather

4、osclerosis(AS).近年发现免疫炎性反应在促进动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)发病中起重要作用［１］。研究发现体内功能最强的专职性抗原提呈细胞树突状细胞(dendriticcell，DC)在AS斑块中聚集增多，提示其所介导免疫炎性反应参与了AS的发生和发展［２］。吸烟是心脑血管疾病的重要危险因素之一［３］，有观察表明吸烟可激活体内的炎性反应［４］，但吸烟是否影响DC功能从而促进AS的发生与发展，目前尚少有报道。本文通过观察吸烟者DC的功能状态，进一步阐明吸烟致AS的可能机制。1对象与方法1.1研究对象选取吸烟和非吸烟者各30例，两组年龄、性别

5、等无明显差异。所有对象均排除急慢性炎性疾病、自身免疫性疾病及肿瘤，未用激素及免疫抑制剂。1.2材料RPMI1640(L-glutamine)培养基、胎牛血清(FCS)购自Gibco公司；淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品有限公司；四唑盐(MTT)、二甲亚砜(DSMO)购自广州威佳公司；重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白介素-4(rhIL-4)购自英国Peprotech公司；PE标记的鼠抗人CD86(B7-2)单抗购自Biolegend公司；白细胞介素-1β(IL-1β)、白介素-10(IL-10)ELISA试剂盒购自美晶公司。1.3方法1.3.

6、1DC制备抽取受试者外周血20ml，淋巴细胞分离液中离心(2000r/min，20min)，收集单个核细胞(PBMC)，PBS冲洗2次，RPMI1640冲洗1次，用完全RPMI1640(含10%FCS)在6孔培养板中培养2h(37℃，5%CO2)，去掉非贴壁细胞。贴壁细胞用完全RPMI1640(含10%FCS、rhGM-CSF100ng/ml、rhIL-4500u/ml)培养液，置37℃、5%CO2温箱中培养7天，隔天半量换液1次。收集培养第7天的悬浮细胞即DC进行实验。1.3.2DC形态于培养第1、3、5、7天在倒置显微镜下观察DC形态。1.3.3流式细胞学分析收集DC

7、细胞，用PE标记的CD86(B7-2)单抗标记细胞，用流式细胞仪(FACS，美国BectonDickinson)检测。1.3.4混合淋巴细胞反应(MLR)反应中淋巴细胞来自其他健康供血员的PBMC，经T细胞尼龙毛柱分离后，得到纯的T淋巴细胞。浓度为2×１０５/ml的T淋细胞与浓度为2×１０４/ml的DC各100μl在96孔平底培养板中37℃、5%CO2条件下混合培养，第4天吸取上清液-20℃保存待测细胞因子，沉淀细胞加MTT液(25μl/孔)，继续培养4h后每孔加DMSO100μl，波长570nm处测A值。1.3.5细胞因子测