嗜酸乳杆菌对螺旋形和球形幽门螺杆菌黏附拮抗作用的研究

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1、嗜酸乳杆菌对螺旋形和球形幽门螺杆菌黏附拮抗作用的研究作者：吴小茜，佘菲菲，李能，陈月秀【摘要】目的研究热灭活状态和活菌状态嗜酸乳杆菌对螺旋形和球形幽门螺杆菌(Hp)的黏附拮抗作用。方法制备人胃上皮腺癌细胞系（AGS）细胞爬片，将两种状态嗜酸乳杆菌和不同形态Hp菌分组按不同顺序加入，作用2h，革兰染色后光镜观察分析Hp黏附指数产生的变化，荧光抗体染色法定性评价黏附于AGS细胞的Hp密度的改变。结果革兰染色后光镜观察分析：排除实验组及竞争实验组与对照组比较，黏附指数均有明显下降（P<0.05）。荧光镜下可见实验组黏附于细胞的Hp密度也明显降低。结论嗜酸乳杆菌对

2、不同形态的Hp均具有黏附拮抗作用。【关键词】乳杆菌,嗜酸;螺杆菌,幽门;上皮细胞;胃肿瘤;细菌黏附;荧光抗体技术TheAntagonismEffectofLactobacillusAcidophilusonAdherenceofHelicalandCoccoidFormsofHelicobacterpylori　　edicalUniversity,Fuzhou350004,ChinaABSTRACT:ObjectiveToinvestigatetheantagonismeffectonadherenceofthehelicalandcoccoidformsofH

3、ptothegastricepithelialcellbytheinactivatedandlivingLactobacillusacidophilus.MethodsTheAGScellseededcoverslipssofHp'sstained,andtheadherenceofHptoAGScellicroscopeandtheadherenceindexetime,byusingFITCconjunctedantibody,thedensityoftheadheredtsofHpicroscopeaftertreatmentuchlosHpoftes

4、tgroupsuchloeffectoncelladherenceofhelicalandcoccoidformsofHp.　　KEYRS液体培养基在厌氧环境下37℃静止培养36h，收集菌液分为活菌和灭活2组，灭活组经75℃水浴灭活30min。无血清无双抗的F12高糖培养液重悬。　　1.1.2螺旋形Hp制备　　用含5%新鲜脱纤维羊血的布氏血平板上（含万古霉素10μg/mL，多粘菌素B2.5IU/mL，TMP5μg/mL），37℃微氧环境中培养和传代。传代后再培养2d的螺旋形Hp以PBS洗下，无血清无双抗的F12高糖培养液重悬。　　1.1.3球形Hp制备　　将Hp

5、传代后再培养2d，用布氏肉汤（含10%小牛血清）洗下细菌，制成菌悬液。加入灭滴灵（终浓度8μg/mL），37℃微氧环境培养，直至Hp全部转为球形（约60h）。经显微镜下观察及再培养无菌生长，确定为Hp已完全球变。以无血清无双抗的F12高糖培养液重悬细菌备用。　　1.2细胞培养和细胞爬片制备　　人胃上皮腺癌细胞系AGS细胞由本系保存，培养液为含10%胎牛血清的F12高糖培养液（含10%胎牛血清，青霉素200IU/mL，链霉素50μg/mL）。置于体积分数为0.05的CO2培养箱中培养，隔天传代，实验所用细胞均处于对数生长期。于6孔板内置盖玻片，每孔接种1×105m

6、L-1密度的细胞液2mL，过夜培养，制成爬片。　　1.3兔抗Hp11637多克隆抗体制备　　超声粉碎菌体后，自家兔耳缘静脉隔周免疫4次后抽心脏血制备血清。间接ELISA法检测抗体的效价：以Hp11637超声抗原包被96孔酶联板，对待测血清进行1∶100～1∶51200倍比稀释后检测。L，细菌浓度为5×107CFU/mL。作用完毕后，取出细胞爬片，PBS洗3次，常规革兰染色后于油镜下观察并随机计数50个细胞上活菌或热灭活状态的嗜酸乳杆菌的黏附数量。推算出每个上皮细胞的黏附指数：黏附指数=黏附嗜酸乳杆菌数/细胞数　　1.4.1.2通过排除、竞争、替换实验观察分析不同

7、状态的嗜酸乳杆菌对螺旋形和球形Hp黏附能力的影响　　（1）排除实验组：将活菌和热灭活状态的嗜酸乳杆菌加入6孔培养板中，在37℃，体积分数为0.05的CO2环境中与AGS细胞作用1h，去除未黏附的嗜酸乳杆菌,然后再分别加入螺旋形Hp、球形Hp悬液，继续孵育1h；(2)竞争实验组：分别将螺旋形Hp、球形Hp悬液与嗜酸乳杆菌活菌组或灭活组悬液同时加入6孔培养板中混匀，37℃、体积分数为0.05的CO2环境中与AGS细胞作用2h；(3)替换实验组：将螺旋形Hp、球形Hp悬液加入6孔板中，37℃、体积分数为0.05的CO2环境中与AGS细胞作用1h后，去除未黏附的螺旋形H

8、p、球形Hp，再加入活菌