生长及凋亡作用的实验研究

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1、生长及凋亡作用的实验研究作者：肖柳英，洪暉菁，潘竞锵，吕俊华，沈文娟【摘要】　　目的利用血清药理学的方法，观察荔枝核含药血清体外的抑制肿瘤细胞生长；并研究荔枝核对小鼠S180，EAC体内、外细胞生长及凋亡作用。方法小鼠S180，EAC细胞混悬液用生理盐水按1:1进行稀释制成含瘤腹水混悬液,在给药前24h,每只小鼠腋窝皮下接种0.2ml。荔枝核水提液对小鼠S180，EAC抑瘤实验连续给药10d。测定肿瘤作用与细胞凋亡表达。结果荔枝核提取物30%含药血清高中剂量和20%含药血清高剂量对HepG2肿瘤细胞具有明显的抑瘤作用，Hochest染色肿瘤细胞出现凋亡形态；而流式细胞仪检测可

2、见30%含药血清高中低剂量的促肿瘤凋亡率分别是63.3%，45.5%和23.8%，明显高于正常血清组。荔枝核水提物能够明显抑制S180，EAC肿瘤的生长（P<0.05），荔枝核提取物对荷S180小鼠高剂量组的抑瘤率达到32.81%。对荷EAC实体瘤小鼠的肿瘤其抑瘤率达到30.62%；结论荔枝核具有抑制小鼠S180，EAC体内、外细胞生长的影响，促进肿瘤细胞的凋亡，从而表现抗肿瘤的作用。【关键词】荔枝核小鼠S180EAC抑瘤作用凋亡　　荔枝核为无患子科植物荔枝LitchichinensisSonn的干燥成熟种子。夏季采摘成熟果实，除去果皮及肉质假种皮，洗净，晒干［1］。荔

3、枝及荔枝核的经济和药用价值逐渐受到关注,近几年来已有多篇报道用荔枝核中药治疗糖尿病的经验［2］，荔枝核具有调血脂、保肝以及抗氧化等作用［3，4］，特别是荔枝核的多糖成分在抗肿瘤、提高机体免疫活性方面具有较大的关注。基于以上的研究，本实验进一步研究荔枝核对荷瘤小鼠体内、外细胞生长及诱导细胞凋亡的影响报道如下。　　1材料　　1.1动物清洁级，新西兰雄性大白兔,购自广东省医学实验动物中心，实验动物质量合格证号：粤监证字2006A001。SPF级小鼠，购自广东省医学实验动物中心，实验动物质量合格证号:粤监证字2006A018。　　1.2仪器CO2恒温培养箱（Thermofora美国）

4、；AIRTECH型医用超净台（苏净集团安泰公司）；XSZ-D型倒置生物显微镜(重庆光学仪器厂)；荧光显微镜（OlympusJapan）；BIO-RAD-450型酶标定量测试仪（美国）；流式细胞仪（FACSCalibur型BectonDickinson）；BIO-RAD电泳仪（美国）；Eppendorf低温高速冷冻离心机（德国）。　　1.3试药荔枝核提取物：颗粒（颗粒∶生药＝1∶10），广东一方制药业有限公司；批号（0604229）。环磷酰胺（CTX）：江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：05010821。　　RPIM1640培养液（GIBCO公司产品），批号1285082；青霉素

5、、链霉素（广州白云山天心制药股份有限公司）；新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司产品），批号060704；胰蛋白酶（DIFICO公司生产）；四甲基偶氮唑盐（MTT，SIGMA公司产品）；二甲基亚砜（DMSO；美国Amresco公司产品）；Hochest33258(碧云天生物技术公司)；PI染料sigma；细胞裂解液(碧云天生物技术公司)；BAX抗体（cellsignaling）；BCL-2抗体（santacruz）；GAPDH抗体（Chemicon）；ECL发光液；pierce批号：HI106361；丙烯酰胺sigma;甲叉丙烯酰胺sigma；SDS-十二烷基磺酸钠si

6、gma；甘氨酸Biorad；TAN滤纸an。　　2方法　　2.1实验技术路线　　2.1.1离体细胞实验　　2.1.2在体动物实验　　2.2含药血清的制备按李仪奎等［5］方法制备含药血清：将体重约1.5kg的健康雄性新西兰大白兔10只随机分为荔枝核颗粒剂高、中、低剂量组和环磷酰胺（阳性对照）组，另设生理盐水（空白对照）组，共5组，每组2只。荔枝核颗粒剂高、中、低剂量组给药剂量分别为168，84，42g·kg-1·d-1，环磷酰胺组给药剂量为42.4g·kg-1·d-1，空白对照组给予等体积生理盐水。各组动物每天灌胃给药或生理盐水，2次/d，每次间隔12h，灌药前4h禁食不禁水，

7、连续3d，末次灌胃1h后，3%戊巴比妥钠麻醉，颈动脉采血，4℃下静置4h，3000r·min-1离心15min，无菌分离血清经56℃，30min灭活处理后，0.20μm微孔滤膜过滤除菌，置－20℃保存备用。　　2.3MTT法检测含药血清对HepG2细胞的抑制率取对数生长期的细胞HepG2细胞，以3×104ml-1的细胞浓度在96孔板上每孔接种100μl，让细胞贴壁生长24h后，以不同浓度组含药血清体积比分别为10%，20%，30%作用于细胞，每组浓度设4个复孔，培养72h后分别测细胞的生长抑制率，重复3