生长及凋亡作用的实验研究论文

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1、生长及凋亡作用的实验研究论文肖柳英，洪暉菁，潘竞锵，吕俊华，沈文娟【摘要】目的利用血清药理学的方法，观察荔枝核含药血清体外的抑制肿瘤细胞生长；并研究荔枝核对小鼠S180，EAC体内、外细胞生长及凋亡作用。方法小鼠S180，EAC细胞混悬液用生理盐水按1:1进行稀释制成含瘤腹水混悬液,在给药前24h,每只小鼠腋窝皮下接种0.2ml。荔枝核水提液对小鼠S180.freelofora美国）；AIRTECH型医用超净台（苏净集团安泰公司）；XSZ-D型倒置生物显微镜(重庆光学仪器厂)；荧光显微镜（OlympusJapan）；BIO-RAD-450型酶标定量测

2、试仪（美国）；流式细胞仪（FACSCalibur型BectonDickinson）；BIO-RAD电泳仪（美国）；Eppendorf低温高速冷冻离心机（德国）。1.3试药荔枝核提取物：颗粒（颗粒∶生药＝1∶10），广东一方制药业有限公司；批号（0604229）。环磷酰胺（CTX）：江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：05010821。RPIM1640培养液（GIBCO公司产品），批号1285082；青霉素、链霉素（广州白云山天心制药股份有限公司）；新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司产品），批号060704；胰蛋白酶（DIFICO公司生产）；四甲基

3、偶氮唑盐（MTT，SIGMA公司产品）；二甲基亚砜（DMSO；美国Amresco公司产品）；Hochest33258(碧云天生物技术公司)；PI染料sigma；细胞裂解液(碧云天生物技术公司)；BAX抗体（cellsignaling）；BCL-2抗体（santacruz）；GAPDH抗体（Chemicon）；ECL发光液；pierce批号：HI106361；丙烯酰胺sigma;甲叉丙烯酰胺sigma；SDS-十二烷基磺酸钠sigma；甘氨酸Biorad；TAN滤纸an。2方法2.1实验技术路线2.1.1离体细胞实验2.1.2在体动物实验2.2含药血清

4、的制备按李仪奎等［5］方法制备含药血清：将体重约1.5kg的健康雄性新西兰大白兔10只随机分为荔枝核颗粒剂高、中、低剂量组和环磷酰胺（阳性对照）组，另设生理盐水（空白对照）组，共5组，每组2只。荔枝核颗粒剂高、中、低剂量组给药剂量分别为168，84，42g·kg-1·d-1，环磷酰胺组给药剂量为42.4g·kg-1·d-1，空白对照组给予等体积生理盐水。各组动物每天灌胃给药或生理盐水，2次/d，每次间隔12h，灌药前4h禁食不禁水，连续3d，末次灌胃1h后，3%戊巴比妥钠麻醉，颈动脉采血，4℃下静置4h，3000r·min-1离心15min，无菌分离

5、血清经56℃，30min灭活处理后，0.20μm微孔滤膜过滤除菌，置－20℃保存备用。2.3MTT法检测含药血清对HepG2细胞的抑制率取对数生长期的细胞HepG2细胞，以3×104ml-1的细胞浓度在96孔板上每孔接种100μl，让细胞贴壁生长24h后，以不同浓度组含药血清体积比分别为10%，20%，30%作用于细胞，每组浓度设4个复孔，培养72h后分别测细胞的生长抑制率，重复3次取平均值采用,结果见图1;实验结果表明：荔枝核提取物30%含药血清高、中剂量和20%含药血清高剂量对HepG2肿瘤细胞具有明显的抑瘤作用。2.4Hochest33258染

6、色检测细胞凋亡将无菌的铺有多聚赖氨酸盖玻片置于六孔板内，以4×105ml-1细胞接种24h后，加入含药血清作用72h后，吸尽培养液，加入0.5ml的固定液，固定10min后，去固定液，用PBS洗3遍，5min/次，加入0.5mlHochest33258染色液，染色5min，边晃动边染色。抗淬灭液封片后，置荧光显微镜下观察，拍片；结果见表1；实验结果表明：其抑瘤作用机理可能与促进肿瘤细胞凋亡有关，如图1可见，Hochest染色肿瘤细胞出现凋亡形态。表1荔枝核提取物含药血清作用HepG2细胞72h的OD值(略)2.5流式细胞仪测定凋亡率取对数生长期的He

7、pG2细胞，以4×105ml-1到25ml玻璃培养瓶，待其贴壁生长24h后，加药72h后，胰酶消化，收集细胞，制成单细胞悬液，用冷PBS洗涤两次，将细胞重悬于70%的冰乙醇固定24h，离心弃乙醇，PBS洗涤1次，滴加已配好的200μl·ml-1Rnase0.5ml，放置4h以上，离心弃上清液，PBS洗涤1次，加0.5ml碘化丙锭（PI），过夜，离心弃PI，再用PBS洗涤1次，立即上机；结果见图2和表2;而流式细胞仪检测可见30%含药血清高中低剂量的促肿瘤凋亡率分别是63.3%，45.5%和23.8%，明显高于正常血清组。2.6肿瘤模型的建立2.6.1

8、小鼠S180，EAC移植性肿瘤模型［6］无菌抽取接种7d后小鼠腹水,加生理盐水稀释使细胞密度达到2×106·