伤寒杆菌实验室诊断研究进展

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1、伤寒杆菌实验室诊断研究进展【关键词】伤寒杆菌；检测方法；实验室诊断　　伤寒是由伤寒杆菌引起的肠道传染病，除引起肠道病变外，还能导致其他器官或全身感染，严重威胁人民的健康。伤寒杆菌的诊断依据主要为临床症状及实验室诊断。肥达试验和细菌培养是诊断伤寒杆菌的传统方法，但敏感性低且费时。近年来出现的免疫学检测方法和聚合酶链反应技术具有较高的特异性和敏感性，且操作简单、快速。本文就伤寒杆菌实验室诊断方法综述如下。　　1细菌培养　　培养是最常用确诊伤寒的诊断依据，由于特异性高，不出现假阳性而被称为金标准。血液和骨髓穿剌液先用亚硒酸盐

2、胱氨酸增菌液进行增菌培养，粪、尿可直接接种于SS培养基，经历37℃24h培养后从SS培养基上挑取较小的无色或淡黄色菌落，首先进行革兰染色镜检，镜下为革兰染色阴性，呈短杆状，无芽胞，无荚膜。挑选可疑菌落，接种双糖铁，作血清学鉴定为沙门菌属D组后，进一步作生化反应，即伤寒杆菌不分解乳糖、蔗糖及鼠李糖，能分解葡萄糖，产酸不产气，赖氨酸脱羧酶阳性，谷氨酸脱羧酶阴性，甲基红试验阳性。副伤寒杆菌形态与伤寒杆菌相似，能分解葡萄糖，产酸产气。临床上伤寒患者在体温上升阶段，在抗生素应用之前作血培养，阳性率可在80%以上，在发病第2周、第

3、3周，粪便培养阳性率可达到60%。培养结果容易受抗生素、培养条件、标本采集的质、量和时间等多因素影响，带菌者检出率较低，结果报告也常需3d～5d的时间。　　2血清学反应　　肥达试验是常用于辅助诊断伤寒的传统方法。其原理是用伤寒杆菌的菌体（O）抗原和鞭毛（H）抗原以及副伤寒甲、乙、丙菌液与稀释的待测血清反应，根据凝集效价判断血清中有无伤寒杆菌的抗体。伤寒病发作后，约在第5天出现O抗体，第10天～第12天产生H抗体。早期肥达试验需要急性期和大约间隔10天的康复期血清，两份标本之间抗O抗体或抗H抗体滴度升高4倍，更有诊断意义

4、。伤寒杆菌的O抗原与A群、B群沙门氏菌有部分相同抗原，与甲、乙两种副伤寒杆菌有一定的交叉反应，因此，肥达反应诊断伤寒杆菌常出现假阳性，特异性差，敏感性低，而且抗原抗体结合出现凝集沉淀常需要20h以上。　　3免疫学方法　　3.1酶联免疫吸咐试验(ELISA)根据抗原或抗体特异性免疫反应原理设计，将已知的抗原或抗体结合在某种固相载体上，以辣根过氧化酶为指示剂，标记在另一种抗原或抗体上，加入酶作用底物，酶与底物发生反应后，底物显色，根据底物显色的深浅定性或定量地检测样本中的抗体或抗原。　　3.1.1双抗体夹心ELISA法检测

5、的是血清中的伤寒杆菌或伤寒杆菌抗原。其原理是：用于包被的抗体和酶标记的抗体是针对伤寒杆菌鞭毛抗原（H抗原）的单克隆抗体。与甲、乙、丙型副伤寒杆菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌等无交叉反应，但伤寒杆菌H抗原仅有的第一相（d），与斯坦利等一些罕见的沙门氏菌有相同的相位，斯坦利菌虽然不引起类似伤寒的疾病，但可使结果出现假阳性；据　　4.3多重PCR多重PCR是在同一个反应管中同时完成多个不同基因扩增的PCR。由于伤寒杆菌有多种不同的抗原基因，只针对鞭毛抗原基因的单一PCR，有时会漏检。多重PCR能全

6、方位高效率地检测伤寒杆菌。Kumar［8］等针对伤寒杆菌的侵袭基因（invA）、O抗原基因（prt）、H抗原基因（fliCd）和表面抗原基因（ViaB）设计不同的引物，在同一PCR反应体系内同时扩增invA、viaB、fliCdandprt基因，以培养法为金标准，对25份水样和伤寒杆菌阳性对照进行检测，结果显示，25份水样均未检出伤寒杆菌，阳性对照最低检测量牛奶和水标本分别为4.8cfu/ml和2.0cfu/ml，并且不出现假阳性和假阴性。与其他常规方法相比，多重PCR灵敏性更高，结果更准确、可靠。　　4.4免疫磁

7、珠分离PCR（IMSPCR）免疫磁珠（immunomagicbead,IMB）就是将直径0.05μl～4μl具有超顺磁性的微粒表面经化学修饰，使之与特异性抗体牢固结合，成为能与特异性抗原结合且有磁性的磁珠。被检测样品在磁板背景下与IMB混合，若有相应的抗原存在，IMB就会将其捕获，利用磁性将IMB聚集，然后进行分离，用于PCR测定。Kumar［9］等用伤寒杆菌抗鞭毛多克隆抗体包被环氧超顺磁珠，人工配制含伤寒杆菌不同浓度的食物和水标本，然后再采用IMB对标本中的伤寒杆菌进行IMS，用于下一步的PCR检测。他们根据伤寒杆

8、菌鞭毛蛋白基因序列，设计一对引物（5TGGGCGACGATTTCTATGCC3、5TTTGCGGAACCTGGTTGGCC3），预期的扩增产物为489bp。对5份肉类、5份牛奶、5份蔬菜、5份水样等标本进行IMSPCR检测，同时用常规PCR平行检测。结果显示伤寒杆菌最低检出量分别为2×105cfu/ml、15×105cfu