抗癌活性肽对胆囊癌ｇｂｃ－ｓｄ细胞作用前后的基因表达谱研究

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1、抗癌活性肽对胆囊癌ＧＢＣ－ＳＤ细胞作用前后的基因表达谱研究作者：云强　苏秀兰　欧阳晓晖　【摘要】目的研究抗癌活性肽对人胆囊癌细胞系GBC-SD细胞作用前后的基因表达谱，筛选与抗癌活性肽作用相关的基因表达改变。方法将1152条人类全长基因的PCR产物按微矩阵排列点样于特殊处理的玻片上制备成表达谱芯片；按一步法抽提抗癌活性肽作用前后体外培养的胆囊癌细胞的RNA并纯化mRNA，通过逆转录用两种荧光Cy3-dUTP和Cy5-dUTP标记对照和实验组胆囊癌细胞cDNA，制成cDNA探针并与表达谱芯片杂交，用ScanArray40

2、00扫描仪扫描芯片上两种荧光信号，计算机分析判定差异表达的基因。结果在1152条基因中筛选出有差异表达的基因245条，其中上调的121条，下调的124条。结论利用本基因表达谱芯片可同时研究数以千计的基因表达水平，从而在基因水平上探讨抗癌活性肽对胆囊癌GBC-SD细胞作用的机制。　　【关键词】抗癌活性肽；胆囊癌；细胞系；基因芯片；基因表达谱　　　　【Abstract】ObjectiveToinvestigategeneexpressionpatternofhumangallbladdercarcinomacellline

3、treatedbyanti-cancerbioactivepeptide(ACBP)，andintheidentificationofnovelcancerassociatedgenes.MethodsThecDNAretro-transcribedfromequalquantitymRNAfromthegallbladdercarcinomacellline(GBC-SD)ixedprobeicroarrayangenes.Itageicroarrayforanalysisofgeneexpressionpatter

4、nsisapoethodtoidentifynovecancerassociatedgenes.　　【Keya；Cellline；Genechip；Geneexpressionpattern　　　　本研究将通过基因芯片技术比较分析抗癌活性肽对胆囊癌GBC-SD细胞的基因表达谱的影响，了解作用前后基因表达的变化，深入探讨这种新型生物活性制剂的分子机制，为肿瘤治疗提供新方法。　　　　1材料与方法　　　　1.1细胞株人胆囊癌GBC-SD细胞由山东大学齐鲁医院肿瘤研究所保存并提供。　　1.2主要试剂与耗材　　1.2.1细胞培养

5、相关试剂　　1.2.2细胞总RNA提取、分析试剂　　1.2.3基因芯片标记、杂交试剂盒上海博星(BioStar)基因芯片有限责任公司。　　1.3实验方法　　1.3.1细胞培养与药物作用胆囊癌细胞按适当密度接种于培养瓶内常规培养，当达到80%融合时，加入活性肽使终浓度达到8mg/ml继续培养48h开始有形态的改变时终止。　　1.3.2探针制备用改进的Trizol试剂一步法抽提培养细胞总RNA。　　1.3.3芯片杂交洗涤按杂交试剂盒说明操作。　　1.3.4检测与分析用ScanArray4000扫描仪扫描芯片，用GenePi

6、xPro3.0图象分析软件分析Cy3和Cy5两种荧光信号的强度和比值。　　　　2结果　　　　2.1总RNA抽提结果所提两组细胞(GBC-SD细胞对照组、GBC-SD细胞实验组)RNAOD260/OD280：1.8～2.0；1%琼脂糖凝胶电泳28s、18s条带清晰，无DNA杂带，证明已抽提高纯化的细胞总RNA。　　2.2芯片杂交结果分析　　2.3基因芯片检测结果总基因位点1152条，归一化选择后基因总数1010条，有差异表达的基因245条，占基因总数的21.27%。其中经活性肽诱导后表达降低的124条，表达增高的121条

7、。　　　　3讨论　　　　利用基因芯片技术可以大规模、高通量、快速高效的对大量基因进行同时研究。表达谱基因芯片是用于基因功能研究的一种芯片，对来源于不同下的细胞内的mRNA或逆转录后产生的cDNA与表达谱基因芯片进行杂交、洗涤，用特有的荧光波长扫描芯片，计算机分析检测结果，对基因表达进行综合的分析和判断，将某个或几个基因与疾病联系起来。　　　　肿瘤的发生、发展是多因素、多阶段、多基因参与的复杂过程，利用基因芯片技术可以平行检测数千条基因，了解药物对基因表达的影响，从而推测药物作用的基因靶点及机制，有利于发挥生物制剂特异性

8、靶向调节作用。　　3.1缺氧诱导因子-1(HIF-1)反应性基因RTP801和内皮素1(ET-1)表达降低HIF-1在多数肿瘤细胞中高表达，上调参与肿瘤增殖和代谢通路的靶基因。其机制主要是通过提高葡萄糖转运、糖酵解速率及形成多血管体系来使肿瘤细胞适应缺氧的环境[2]。其功能可分为：①促进糖酵解：能使肿瘤细胞适应不利环境，减少有氧代