激光扫描共聚焦显微镜中荧光强度的测定条件研究

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1、激光扫描共聚焦显微镜中荧光强度的测定条件研究　　【摘要】目的本文对应用激光扫描共聚焦显微镜进行荧光强度的测定条件做了详细的分析。方法选择和设置激光扫描共聚焦显微镜的各参数，对用间接免疫荧光法检测改性后的材料表面对人牙龈成纤维细胞分泌细胞外基质纤粘连蛋白FN和I型胶原的影响进行荧光强度的定量。结果细胞在材料表面接种后FN的荧光染色强度在四组材料之间差异无显著性，说明材料表面化学成分的改变对FN的形成没有明显影响。但四组材料对I型胶原分泌的影响有差异。结论选择和设置适合的激光扫描共聚焦显微镜中荧光强度的测定条件，可以真实有效的反映实验的结果。　　关键词激光扫描共聚焦显微

2、镜荧光强度　　　　Theresearchondetermineconditionoffluorescenceintensityinconfocallaserscanningmicroscopy　　　【Abstract】ObjectiveToexploretheconditionsunderinedinconfocallaserscanningmicroscopy.MethodsTheparametersofconfocallaserscanningmicroscopyodificationsontheresponseofthefibro-conglutination

3、albumenandtypeIcollagenofhumangingivalfibrobˉlastsonindirectimmunityfluorescenceeasured.ReˉsultsAfterthecellsgraftedonthematerialsurface，thefluorescencedyeintensityofthefibro-conglutinationalbuˉmenhadnonotabledifferenceinmaterialsofthefourgroups，thealterofthechemistryponentofthemateria

4、lsurˉfacehadnonotableinfluenceontheformationofthefibro-conglutinationalbumen.ButtheeffectsofthetypeIcollaˉgenaterialsofthefourgroups.ConclusionSettingappropriateconditionsforthedeterminationoffluorescenceintensityinconfocallaserscanningmicroscopyisimportantintheanalysisofthetrueresults

5、ofexperiˉment.Keyicroscopyfluorescenceintensity　　激光扫描共聚焦显微镜（confocallaserscanningmiˉcroscopy，CLSM）是20世纪80年代发展起来的目前世界上最先进的分子细胞生物学分析仪器。它是在荧光显微镜基础上加装了激光扫描装置，使用紫外或可见激光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，较传统显微镜有着不可比拟的优越性［1］，已广泛应用于分子细胞生物学、生理学、病理学、免疫学、药理学、遗传学等领域，成为这些领域新一代强有力的研究工具，对生物样品进行定性、定量、定时和定位研究

6、具有很大的优越性。　　1材料与方法　　1.1实验用样品分四组。Ti组:未涂层的对照组;HA组:应用离子束辅助沉积技术在种植体表面沉积羟基磷灰石HA涂层;TCP/HA组:应用离子束辅助沉积技术在种植体表面沉积磷酸三钙/羟基磷灰石TCP/HA复合涂层;RGD组:应用化学方法在纯钛表面共价接枝生物活性肽RGD（Arg-Gly-Asp，精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸）。样品规格:直径10mm，厚2mm的圆盘形，表面粗糙度Ra值均为0.1μm。　　1.2实验步骤（1）接种到材料表面的细胞分别培养3、24和48h后，PBS轻轻冲洗3次。（2）4%福尔马林固定10min，PBS冲洗。

7、（3）0.1%（V/V）TritonX-100渗透5min，PBS冲洗。（4）1%的羊血清阻断20min。（5）分别用下列抗体37℃孵育1h:①兔抗人FN多克隆抗体（1:30稀释，Sigma）;②兔抗人I型胶原多克隆抗体（1:30稀释，Sigma），PBS冲洗3次。对照组一抗用无荧光的兔血清。（6）用TRITC标记的羊抗兔IgG（1:30稀释，Sigma）37℃孵育1h，PBS冲洗3次。（7）激光扫描共聚焦显微镜（LEicaTCS-NT，Germany）取图，每个试样随机选择30个细胞测量细胞荧光强度。取图条件:①激发光波长:567nm，②扫描方式:xyz，③物