缺血性脑损伤中ｈｓｐ７２对神经元保护作用的实验研究

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1、缺血性脑损伤中ＨＳＰ７２对神经元保护作用的实验研究作者：张芳　刘红芝　张兆成　宋远见【摘要】目的探讨缺血性脑损伤中HSP72对大鼠神经元的保护作用及其分子机制。方法将SD大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注对照组、热休克处理组、HSP72反义寡核苷酸组及溶剂组。采用焦油紫染色、免疫印迹检测大鼠缺血再灌注后海马神经元损伤和脑组织AKT、Bad(Ser136)的磷酸化情况。结果热休克处理组与缺血再灌注对照组、HSP72反义寡核苷酸组和溶剂组相比海马神经元损伤减轻，脑组织AKT和Bad(Ser136)磷酸化升高(P<0．0

2、5)。结论HSP72可能通过升高脑组织中AKT和Bad(Ser136)的磷酸化程度起到海马神经元保护作用。　　【关键词】缺血性脑损伤；HSP72；AKT；Bad(Ser136)　　　　【Abstract】ObjectiveToinvestigatethemolecularmechanismofneuroprotectionofHSP72duringBraininjuryinducedbyischemia.MethodsSDratslyinto5groups:sham-operated;cerebralischemi

3、aandreperfusion;cerebralischemiaandreperfusion+heatshocktreatment;cerebralischemiaandreperfusion+antisenseoligonucleotidesandreperfusion+solvent.BraininjuryinhippocampusofratsandchangeofphosphorylationofAKTandbad(ser136)munoblotassay.Resultsparingiaandreperfusio

4、ngroup,antisenseoligonucleotidesandsolventgroup,thebraininjuryandphosphorylationofAKTandbad(ser136)ofheatshocktreatmentteamincreasedsignificantly.ConclusionHSP72protectedtheneuronsinhippocampusfromischemiabyincreasingphosphorylationofAKTandbad(ser136).　　【Keyicb

5、raininjury;HSP72;AKT;Bad(Ser128)　　　　热休克蛋白（HSPs）因具有细胞抗氧化保护作用而成为研究的热点。高温能诱导热休克蛋白合成，HSP72是增强热耐受力的诱导型HSPs的一种,但是它对缺血性脑损伤后神经元的保护机制尚不十分清楚。2008年1月至2008年9月，笔者通过观察HSP72对大鼠全脑缺血再灌注损伤后神经细胞凋亡及AKT和Bad(Ser136)磷酸化的影响，以探讨其对大鼠神经元的保护作用及机制。　　1材料与方法　　1．1动物及分组雄性健康SD大鼠40只，体质量250～300

6、g，清洁级。将大鼠随机均分为两组，缺血15min再灌5d为甲组，再灌12h为乙组。各组又分为假手术组、缺血再灌注对照组、热休克处理组、HSP72反义寡核苷酸组，各5只。　　1．2方法　　1．2．1动物模型制备用20%水合氯醛(300～350mg/kg)腹腔注射麻醉动物后，分离双侧颈总动脉并电凝椎动脉[1-2]。手术第2天于动物清醒状态下结扎双侧颈总动脉，使全脑缺血15min，然后不同的时间再灌注。缺血时保持其直肠温度在36．5℃～37．5℃。以缺血动物体征表现判断缺血模型的可靠性。假手术组的处理同实验组，但不结扎双

7、侧颈总动脉。热休克处理组于缺血前2h置于42℃温箱中热休克预处理40min，HSP72反义寡核苷酸组在热休克预处理的同时腹腔注射HSP72反义寡核苷酸0．5ml（5’-TGTTTTCTTGGCCAT-3’,浓度200μmol/L）[3]。　　1．2．2样品制备和免疫印迹甲组于再灌注第5天，以水合氯醛麻醉大鼠，然后以生理盐水和4%多聚甲醛进行心室灌注[1]。取脑组织在4℃多聚甲醛中固定1d以上后，于梯度乙醇溶液中脱水并在二甲苯中透明。包蜡后的脑组织进行切片(5μm)，经脱蜡、二甲苯，最后放于焦油紫溶液中染色。取海马CA

8、1区1mm内的细胞数量作为计数标准。乙组于再灌注12h将大鼠快速断头取脑，分离双侧海马，置液氮中冻存备用。以下操作均在冰水浴中进行。从液氮中取出海马，加1．7ml匀浆缓冲液，用Teflon匀浆器高速匀浆（10s×6次），800g×10min离心，弃上清液，加入0．6mlbufferB振荡摇匀，12000g×10min离心，取上清，