增加乙酰胆碱对缺血性脑损伤的保护作用研究

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1、第二军医大学硕士学位论文增加乙酰胆碱对缺血性脑损伤的保护作用研究姓名：董文哲申请学位级别：硕士专业：药理学指导教师：苏定冯201205增加乙酰胆碱对缺血性脑损伤的保护作用研究摘要研究目的：脑卒中具有发病率高、致残率高、死亡率高等特点，严重危害人类健康和生命安全。并且比较棘手的是，发牛过脑卒中的患者，易复发。每复发一次，病情会加重一次。脑卒中给人类健康和生命造成极大威胁，给患者带来极大痛苦，家庭及社会负担沉重。所以，预防和治疗脑卒中已经成为科学研究迫切需要解决的问题。胆碱能系统，包括乙酰胆碱(acetylocholine，ACh)，囊泡型

2、ACh转运体(vesicularAChtransporter，VAChT)，胆碱乙酰化转移酶(cholineacetyltransferase，CHAT)，ACh受体，高亲和力胆碱摄取，胆碱酯酶MJ。对于胆碱能系统的作用研究，先前的工作主要集中在胆碱能抗炎作用方面。通过胆碱能抗炎通路(cholinergicantiinflammatorypMhway，CAP)发挥作用。胆碱能抗炎通路(cholinergicantiinflammatorypathway)是指迷走神经传出纤维在各种刺激因素作用下，传出冲动增加，促使其丰要递质乙酰胆碱(ac

3、etylocholine，ACh)大量释放，从而抑制网状内皮系统的组织巨噬细胞活化，阻止某些细胞因子的生成和释放，最终抑制局部或全身的炎症反应。其作用丰要是通过迷走神经释放的乙酰胆碱(ACh)与巨噬细胞及其他分泌细胞因子细胞表达的a7烟碱型乙酰胆碱受体(a7nicotinicacetylcholinereceptor，a7nAChR)相互作用抑制细胞因子的合成。研究显示激活胆碱能通路在休克、心梗等方面具有明显地保护作用，但其在对脑卒中的作用少有报道。由于胆碱能主要通过ACh发挥作用，我们本项研究，直接通过增加内源性ACh，观察其对急性缺

4、血性脑损伤的影响，并对其具体作用机制进行探讨。实验设计和方法：实验一：观察胆碱酯酶抑制剂新斯的明对SD大鼠急性缺血性脑损伤的影响。20只SD大鼠(280g左右，雄性)随机分为2组，一组给予溶媒作对照组，另外一组给予新斯的明注射液(40I．tg／kg)，均采用腹腔注射给药。给药15rain后，利用大脑中动脉栓塞(MCAO)制作急性脑缺血模型，术后24h神经学评分，然后麻醉处死动物，取脑1％TTC染色分析。实验二：观察胆碱酯酶抑制剂新斯的明对急性缺血性脑组织凋亡的影响。20只SD大鼠(280g左右，雄性)，分组及处理同实验一，MCAO手术后

5、24h将大鼠断头取脑，提取总蛋白后进行westernblot蛋白印迹检测信号通路蛋白表达含量差异，包括第二军医大学硕士学位论文Caspase一8、Bcl．xl／Bax、Caspase．12、Bad、Bcl．2等的表达。实验三：观察胆碱酯酶抑制剂新斯的明对急性缺血性脑组织炎症因子表达的影响。使用实验二动物，麻醉后，取血，离心后留血清，利用EILSA检测方法，测定IL．10【、IL．113、IL．6和TNF．Ct的含量。实验四：确定新斯的明对急性脑缺血损伤保护作用的M、N受体机制。将40只2809左右雄性SD大鼠随机分为4组，分别给予不同药

6、物处理：第一组给予溶媒；第二组给予新斯的明注射液(40gg／kg)；第三组给予新斯的明+M胆碱能受体阻断药山莨菪碱(200mg／kg)；第四组给予新斯的明+N胆碱能受体阻断药维库溴铵(400gg／kg)，均采用腹腔注射给药；给药15min后，利用大脑中动脉栓塞(MCAO)制作急性脑缺血模型，术后24h神经学评分，然后麻醉处死动物，取脑1％TTC染色分析。实验五：确定新斯的明对急性脑缺血损伤保护作用的是否通过a7nAChR：使用a7nAChR基因敲除小鼠20只，以及野牛型小鼠20只，2种动物均随机分为两个组，分别给予溶媒以及新斯的明(80

7、gg／kg)，腹腔注射。给药15min后，利用大脑中动脉栓塞(MCAO)制作急性脑缺血模型，术后24h神经学评分，然后麻醉处死动物，取脑l％TTC染色分析。实验结果：一、新斯的明腹腔注射，能显著地减轻SD大鼠的半脑梗死面积，对急性缺血性脑损伤有很好的保护作用。二、新斯的明腹腔注射，检测MCAO术后的SD大鼠脑组织中蛋白表达含量，发现与对照组相btCaspase．8活性形式表达含量明显增高；Caspase．12含量没有明显变化；Bcl．xl／Bax表达含量比值明显升高。三、分别取2组动物血清用EILSA法检测多种炎性细胞因子含量，与对照组

8、相比，给药组可显著降低大鼠血清中促炎因子n师a和IL．6水平，而IL．10【、IL．1p的水平无差异。四、新斯的明腹腔注射，能显著地减轻SD大鼠的半脑梗死面积，对急性缺血性脑损伤有很好的保护作用；新斯的明同