过表达bclx1的转基因小鼠对缺血性脑损伤的保护作用的实验研究

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1、华中科技大学博士学位论文过表达bcl-x1的转基因小鼠对缺血性脑损伤的保护作用的实验研究姓名：王芙蓉申请学位级别：博士专业：神经病学指导教师：张苏明2003.4.1丰一r甘t土学■舜‘学克2003■■士●t蠢文过表达矗c卜x1的转基因小鼠对缺血性脑损伤的保护作用的实验研究摘要，l随着对脑缺St研究的不断深入，人们逐渐认识到缺血性脑损害后缺St区域内细)9缸坏死，细胞凋亡，细胞DNA损伤相对集中的区域由中心向外周分布开来。近年来，脑科学研究者主要致力于干预细胞凋亡及DNA损伤来最大限度地减少神经元丢失。细胞凋亡是程序性细胞死亡，一旦启动，则不可逆。对细胞凋

2、亡的研究已经证明，caspases的蛋白酶解级联反应控制着凋亡的发生与发展。该级联激活反应主要有两条途径：一为线粒体依赖途径，指DNA损伤可促使线粒体释放细胞色素C，在ATP或dATP存在下，细胞色素C使凋亡蛋白酶活化因子一1(Apaf-1)发生构象变化而活化，活化的Apaf-1促使procaspase．9自身活化，然后再激活下游的caspase．3，．切割特定的凋亡底物，诱发细胞凋亡；另一条为死亡受体途径，是指能与特异配基结合的死亡受体Fas、TNFRI、DR3、DR4或DtL5，经接头蛋白介导，级联caspase．1、．6、．8或．10，活化下游的效

3、应酶caspase．2、．3、一7等，诱发凋亡反应。在抗凋亡的基因簇中，bcl一2基因起着重要作用。Bcl．xl基因属于bcl．2基因家族，主要表达于线粒体内膜，核膜和内质网膜。近年来的研究发现，在脑缺血及再灌注损伤中，bcl．xl基因起着重要的脑保护作用。有学者提出，通过调控抗凋亡基因的表达来治疗脑梗塞是未来分子水平治疗的一种新的方向。自本世纪80年代发展起来的转基因技术使得单个特定的基因能整合进研究对象的基因组，从而能在生物个体的整体水平来观察某一基因的生理、病理作用，这是以前在细胞水平研究基因转染、表达所不可能达到的水平，也是真正从整体上、活体的、

4、系统的来观察基因的行为，目前，转基因动物的研究应用非常广泛，因而大大拓宽了生物领域的研究范围。从基础理论到应用技术，从实验室到社会化生产均有了很大的发展。转基因的方法主要有：显微注射法、逆转录病毒载年．r．

5、t太蠢一许‘膏虎2003■■士霹t{分文—————————————————————————————————————一体法、胚胎干细胞介导法，电脉冲介导法、磷酸钙介导法、精子载体法等。由于显微注射法得到子代动物的外源基因携带率和表走势都较高，而此种方法相对较成熟，并被大家广泛接受，因而最常被采用。／本课题拟采用显微注射法产生过表达bcl—xl基因的转基

6、因小鼠，结合小鼠局灶性脑缺血模型，并利用多种分子生物学技术、TUNEL及免疫组化，观察过表达bcl—xl基因在缺血性脑损伤中所发挥的作用，探索bcl—xl基因与DNA损伤及细胞凋亡的内在关系，研究bcl．xl作用发生的机制，从而寻求在分子水平可能的脑保护措施。／研究方法‘一1．构建bcl—xl的表达质粒，并将其纯化及线性化，利用显微注射法将其注射入受精卵中，将注射后的受精卵移植入假孕鼠的输卵管中，生出bcl．xl转基因小鼠。用PCR及southern-blot检测子代小鼠中bcl-xl基因在小鼠基因组中的整合，用RT-PCR检测bcl．xlmRNA的转录

7、，用Western．blot检测bcl．xl蛋白质的表达，鉴定其是否为bcl．x1基因过表达的合格的转基因小鼠。2．将检测获得的转基因阳性鼠作为首建者，采用阳性转基因小鼠与正常的昆明白小鼠交配繁殖传代方法，保持其杂合子形式，避免因近交繁殖易带来的近交衰退以及繁殖能力下降等问题。然后进行PCR及Southern．blot检测以了解子代中外源基因的整合情况，用RT-PCR及Western．blot方法半定量研究各系列转基因小鼠外源基因的转录和表达情况，观察外源基因的复制和传代的稳定性。同时，用RT-PCR方法半定量检测了人bcl-xl基因在转基因小鼠脑、肝、

8、肾脏和骨骼肌中的表达情况，GAPDH被用来作为内参照。3．选择BALB／c和昆明白两种小鼠，同时对它们进行线栓，同时观察小鼠品系、小鼠体重、线栓粗细、以及术后温度对小鼠的神经功能评分和梗塞体积的影响，以期建立稳定的、可重复的转基因小鼠模型。4．将转基因小鼠与野生型小鼠同时行线栓永久性阻塞大脑中动脉，在缺血24h时测其神经功能评分，观察转基因小鼠与野生型小鼠的差别。在缺血后不同时间点测其梗塞体积，观察梗塞体积的动态变化。用TUNEL法观察小鼠的脑组织2弗-r．}藏土曩一许‘掌屯2003●尊士季t鲁文—————————————————————————————

9、—一缺敷后不同时间点再灌注时凋亡细胞的数量和分布情况。用免疫缎化方法观察梗塞前后