石斛属植物rbcl基因序列变异和系统发育初步研究

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1、石斛属植物rbcL基因序列变异和系统发育初步研究【摘要】目的探讨10种石斛植物叶绿体rbcL基因序列变异和系统发育关系。方法根据Genebank已经公布的植物rbcL基因序列设计一对引物，用于石斛rbcL基因PCR扩增。基因序列排列用ClustalX软件完成，应用Seqnconverter软件分析序列的长度、GC含量、GpC量、GCskeaximumparsimonymethod）获得最大简约系统树；应用自展法（bootstrap）检验系统树，自展次数为1000次。结果10种石斛植物叶绿体rbcL基因的长度范围为944～950bp，其中536bp为保守位点，4

2、66bp为变异位点，439bp为具有系统发育信息的信息位点。基因中GC含量为40.61%～41.37%，GpC含量为4.03%～4.78%，GCskeplants.MethodsApairofprimersplifytherbcLgene.Genesequence,thecontentsofG+C,thecontentsofGpC,thevalueofGCskeaximum-parsimony(MP)method.Bootstrapanalysisplingsofthedataset.Results944～950bpnucleotidesDendrobiump

3、lants.Conservedsites,variablesitesandphylogeicallyinformativesitesphylogeny.　　Key;rbcLgene;Sequenceanalysis;Phylogeny　　石斛是我国传统贵重中药材，现代药理研究证明其具有增强免疫、抗肿瘤、抗衰老、治疗白内障等作用［1］。由于石斛属植物集药用和观赏于一体，被过度地开发利用，加上生境的破坏及自身生长缓慢等原因，石斛野生资源濒于绝灭。迄今为止，石斛属植物的研究已在形态学、比较解剖、植物化学、同工酶和等位酶等方面积累了许多资料［2，3］。运用PCR和DN

4、A测序等方法，从分子系统学角度对石斛进行研究也有一些报道，所选择的基因包括matK基因［4］和rRNA基因［5］。l，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）是一种具有羧化和加氧双重功能的酶，在光合作用和光呼吸中都起着重要作用。Rubisco酶由15个亚基组成，包括8个大亚基和8个小亚基。其中大亚基基因（rbcL）由叶绿体基因组编码，小亚基基因（rbcS）由核基因组编码，其中rbcL基因已经成为分子系统学研究中使用最为广泛的分子指标之一。为此，本文尝试对10种石斛植物rbcL基因进行测序并分析，旨在为研究石斛植物的系统发育提供核苷酸序列方面的证据。　　

5、1材料实验所用石斛植物采自云南的原始森林，现被整丛栽种于山东理工大学生命科学学院植物组织培养实验室以便及时取材和观察。见表1。　　2方法　　2.1总DNA的提取　　取各样品新鲜原植物的叶片，采用改良的CTAB法提取基因组DNA［6］，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测其质量，并在紫外分光光度计下检测其浓度，稀释标定到10ng/μl，放入-20℃冰箱里储存备用。　　2.2rbcL-PCR反应体系　　PCR反应在PTC-200型梯度热循环仪上进行，PCR扩增反应总体积为50μl，其中包括50mmol/LKCl，10mmol/LTrisHCl(pH9.0)，1.5mmol/

6、LMgCl2，200μmol/LdNTP，50～100ng基因组DNA，1UTaq聚合酶和0.1μmol/L引物。根据Genebank上已经公布的植物rbcL基因序列设计一对引物，用于rbcL基因片段PCR扩增，其中上游引物P1为：5′-GAGAGACTAAAGCAAGTGTTGGA-3′，下游引物P2为：5′-ATGATCTCCACCAGACATACGA-3′。引物由上海生工生物技术有限公司合成，PCR扩增程序为94℃变性3min；94℃50s，56℃1min，72℃1min，循环35次，72℃延伸10min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，用Alpha2

7、200凝胶成像系统观察结果。　　2.3PCR产物的纯化与测序　　使用上海生工公司柱式DNA胶回收试剂盒进行回收，由博尚生物技术有限公司测序，测序引物与PCR反应引物相同。　　2.4数据处理　　基因序列用ClustalX软件排列，应用Seqnconverter软件分析序列的长度、GC含量、GpC量、GCskeaximumparsimonymethod）获得最大简约系统树；应用自展法（bootstrap）检验系统树，自展次数为1000次。表1实验材料来源及采集地（略）　　3结果　　3.1石斛rbcL基因序列分析　　利用Seqnconverter分析软件对10种石斛

8、材料进行长度、GC含量、GpC量、GC