sil15rα与脾细胞孵育后对小鼠黑色素瘤细胞生长的免疫调节作用

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1、sIL15Rα与脾细胞孵育后对小鼠黑色素瘤细胞生长的免疫调节作用：顾艳宏,王榕生,束永前,徐强【摘要】目的:研究可溶性IL15Rα与脾细胞共同孵育后对小鼠黑色素瘤细胞生长的免疫调节作用。方法:制备小鼠脾细胞,分成两组,一组加入可溶性重组IL15Rα(sIL15Rα),另外一组不加,培养48h后,分离两组的贴壁细胞和非贴壁细胞,流式细胞术(FCM)分析CD4、CD8、B220、CD11c、CD1a的表达;并把上述4组细胞（即脾细胞非贴壁细胞组,脾细胞贴壁细胞组,脾细胞+sIL15Rα非贴壁细胞组,脾

2、细胞+sIL15Rα贴壁细胞组）和黑色素瘤细胞一起分别注射到小鼠腹部皮下,观察小鼠腹部皮下肿瘤生长抑制情况,对照组只注射小鼠黑色素瘤细胞。结果:脾细胞+sIL15Rα贴壁细胞组小鼠黑色素瘤的生长速度显著小于其他各组;FCM分析,此组细胞主要成分可能为树突状细胞（DC）。结论:sIL15Rα与脾细胞共同孵育后,可能通过DC的作用,对黑色素瘤的生长进行免疫调节,从而抑制瘤细胞的生长。【关键词】sIL15Rα;IL15;树突细胞;黑色素瘤IL15属于IL2家族,它与IL2共用β和γ受体进行信号传导

3、,但同时又拥有自己独特的α受体,是与IL2功能有所不同的一种T细胞生长因子［1］。在生理条件下,IL15与膜上的IL15Rα结合,但一般认为,只有在出现IL2/15Rβ和γc时,才能进行信号传导［2］。IL15Rα分布广泛,在很多组织和细胞都能被检测出来,例如脑、肠、肝、外周血单核细胞（PBMC）等。它在体内以两种形式存在,一种是膜型,一种是可溶型,可通过自分泌、内分泌、旁分泌或近分泌形式作用于靶器官和组织。其中,可溶型的IL15Rα（sIL15Rα）相对分子质量（Mr）为42000,在生理条

4、件下,很低的浓度（pmol/L）就能与IL15有很高的亲和力。现在认为,这种sIL15Rα是锚在膜上的IL15Rα通过金属蛋白酶水解后脱落的,它可以阻断IL15与细胞膜表面受体的连接,抑制IL15的作用。因为sIL15Rα对IL15有高亲和力,有假说认为,sIL15Rα可能扮演一种类似分子清洗物的作用来去除多余的IL15;当然,它们之间的这种高亲和力的结合也许还起到其他作用,目前仍不清楚［3,4］。本实验中,我们把sIL15Rα与脾脏细胞共同孵育后,进一步研究其对小鼠黑色素瘤生长的影响。

5、1材料和方法1.1材料6～8周龄的雄性C57BL/6小鼠,质量22～25g购自扬州大学实验动物中心。饲养温度为25℃左右,光照周期为光照12h,黑暗12h（12L:12D）,自由采食、饮水。小鼠黑色素瘤细胞（B16）为本实验室长期拥有,培养于RPMI1640培养液中,含100mL/L新生小牛血清,10万U/L的青霉素/链霉素(INVITROGEN)。CD4、CD8、B220、CD1a、CD11c单克隆抗体（mAb）均购自美国BD公司。小鼠IL15、IL2、IFNγELISA试剂盒购自RD公司。可溶性重

6、组IL15Rα/Fc嵌和体(sIL15Rα)购自RD公司。1.2方法1.2.1小鼠脾细胞的制备拉颈椎处死小鼠,无菌条件下取出脾脏,放入盛有RPMI1640完全培养液的平皿中,研磨,过滤,获得粗制的脾细胞悬液;4℃低速离心1000r/min,5～10min,弃上清,重悬细胞,加入预冷TrisNH4Cl红细胞裂解液1mL,轻轻吹打混匀,室温静置1～2min,溶解红细胞;加5mLRPMI1640完全培养液终止反应,Hank’s液洗2次,最后将沉淀细胞重悬于2mLRPMI1640完全培养液中;细胞计数及测定存

7、活率。1.2.2FCM检测把上述制备的小鼠脾细胞,分成两组,一组加入可溶性重组IL15Rα(sIL15Rα),另外一组不加,培养48h后,分离两组的贴壁细胞和非贴壁细胞,用FCM分析其组分。即把上述4组细胞:脾细胞非贴壁细胞组（SCNA）,脾细胞贴壁细胞组（SCAD）,脾细胞加入IL15Rα非贴壁细胞组（SC+sIL15RαNA）,脾细胞加入IL15Rα贴壁细胞组（SC+sIL15RαAD）,分别用PBS洗涤2次,将细胞重悬于PBS中,加入抗CD4PE、CD8PE、CD11cPE、CD1a

8、、B220PE。充分混匀,置4℃黑暗中孵育30min,PBS洗涤2次后,用FCM检测。1.2.3动物实验共60只小鼠,分5组。第1组为对照组,注射小鼠黑色素瘤细胞,其余4组分别注射上述培养48h后分离的细胞（即SCNA、SCAD、SC+sIL15RαNA、SC+sIL15RαAD）和小鼠黑色素瘤细胞的混悬液。具体如下:用750mL/L乙醇消毒小鼠腹部皮肤,用注射器吸取上述细胞悬液0.2mL（5×105）,接