cgmp依赖性蛋白激酶ⅱ对胃癌细胞bgc823迁移的影响

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1、cGMP依赖性蛋白激酶Ⅱ对胃癌细胞BGC823迁移的影响：任峰,高倩,陶燕,桑建荣,杨小明,范少华,陈永昌【摘要】目的：研究cGMP依赖性蛋白激酶Ⅱ(cGMPdependentproteinkinaseⅡ,PKGⅡ)对胃癌细胞株BGC823迁移活动的影响,并对其作用机制进行初步探讨。方法：以携带PKGⅡ基因的腺病毒结构AdPKGⅡ感染胃癌BGC823细胞,用蛋白质印迹法及免疫荧光检测感染病毒后PKGⅡ的表达。用特异性PKGⅡ激活剂8pCPTcGMP作用感染病毒的细胞,通过Boyden槽迁移率、刮除迁移分析法分析PKGⅡ高表达和活性增高对Ras同源性蛋白A(R

2、ashomologA,RhoA)激动剂溶血磷脂酸(lysophosphatidicacid,LPA)诱导的胃癌细胞迁移的影响。结果：胃癌细胞株BGC823在感染AdPKGⅡ后高表达PKGⅡ,经cGMP类似物8pCPTcGMP激活后,使RhoA活化诱导的细胞迁移活动受到明显抑制,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论：PKGⅡ能明显抑制胃癌细胞株BGC823的迁移。【关键词】cGMP依赖性蛋白激酶Ⅱ;胃癌细胞;细胞迁移　　[Abstract]Objective:ToinvestigatetheeffectofcGMPdependentprote

3、inkinaseⅡonthegastriccancercellmigration.Methods：AnadenovirusencodingPKGⅡgenemunofluorescencemicroscopy.ThecellsologA(RhoA)agonistlysophosphatidicacid(LPA)inducedcellmigrationinedbyBoydenscrapemigrationassayandchambermigrationassay.Results：ThePKGⅡexpressioningastriccancercellBGC823igra

4、tion(P<0.05,paredigrationofhumangastriccancercells.　　[Keyigration　　cGMP依赖性蛋白激酶(cGMPdependentproteinkinaseG,PKG)是广泛存在于真核细胞内的一类丝/苏氨酸蛋白激酶。现有的研究表明,PKGⅠ在某些肿瘤组织中的表达水平比正常组织明显降低,将外源PKGⅠDNA转染细胞,则可抑制裸鼠模型中肿瘤细胞的生长和侵袭[1];PKGⅠ也有助于细胞的黏附链接,增加细胞的接触抑制,抑制血管的再生和肿瘤的生长[2,3]。这表明PKGⅠ具有一定的抗肿瘤作用[4],是一种新的肿瘤抑制因子

5、[5]。对于PKGⅡ,已有资料显示其对细胞的增殖具有抑制作用[6],而我们最近又发现PKGⅡ在胃癌细胞中的表达明显降低[7],并且对胃癌细胞的增殖活动具有明显的抑制作用[8]。但是,PKGⅡ是否对胃癌细胞的迁移活动同样具有抑制作用,还未见明确报道。本研究旨在利用腺病毒表达载体,将PKGⅡ基因导入胃癌细胞,使其高表达,并以特异性PKGⅡ激活剂8pCPTcGMP作用感染细胞,激活PKGⅡ,观察活化的PKGⅡ对胃癌细胞迁移活动的影响。　　1材料和方法　　1.1材料　　人胃癌细胞BGC823由上海细胞生物研究所提供;小牛血清购自兰州民海生物公司;DMEM购自Gibco公司

6、;PKGⅡ抗体购自Abgent公司;羊抗兔IgG多克隆抗体购自中杉公司;8pCPTcGMP购自Calbiochem公司;Boyden迁移槽购自Costar公司;ECL购自AmershamBiosciences公司;携带LacZ和PKGⅡ基因的腺病毒载体由本实验室构建。其他试剂均为国产或进口分析纯。　　1.2细胞培养　　人胃癌细胞株BGC823用含10%小牛血清的DMEM,置于37℃、5%CO2的孵育箱中培养。待细胞铺满瓶底后,用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA的混合消化液消化,传代培养。感染病毒前一天接种细胞,细胞密度调整为70%。　　1.3蛋白质印迹法检测

7、PKGⅡ表达　　将胃癌细胞BGC823接种到6孔板中,细胞密度为5×105/孔。携带PKGⅡ基因的重组腺病毒(AdPKGⅡ)分别按感染复数(multiplicityofinfection,MOI)为0,50,100感染胃癌细胞BGC823。培养24h后,提取感染病毒细胞的总蛋白,以10%SDSPAGE电泳分离,4℃，90mA恒流转膜过夜。结束后,取出PVDF膜在5%脱脂牛奶中室温封闭1h。将膜以适量的一抗稀释液(兔抗人PKGⅡ单抗按1∶200稀释,山羊抗人GAPDH单抗按1∶1000稀释)室温下摇床孵育2h,以HRP标记的羊抗兔I