pires2egfphbmp2载体的构建及对人牙龈成纤维细胞表型的影响

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1、pIRES2EGFPhBMP2载体的构建及对人牙龈成纤维细胞表型的影响　　【Abstract】AIM:ToconstructandidentifytheeukaryoticexpressionvectorpIRES2EGFPhBMP2anhBMP2andtoobserveitseffectsonthephenotypeofhumangingivalfibroblast.METHODS:hMBP2genehumanosteogenicsarabyRTPCRandinsertedintoTvector.AfterDNAsequencingverification,iticros

2、copeandP2ontheproliferation,ALPactivity,contentofOCandtheexvivomineralizationcapacityoffibroblastbyMTT.RESULTS:HumanBMP2geneangingivalfibroblastbutincreasedtheALPactivity,OCcontentandexvivomineralizationcapacity.CONCLUSION:TheeukaryoticexpressionvectorpIRES2EGFPhBMP2expressinghBMP2isconstructe

3、dsuccessfullyandthisgenepromoteshumangingivalfibroblasttodifferentiatetoorphogeicprotein2;transfection;osteoblasts　　【摘要】　目的：构建hBMP2基因的真核表达载体pIRES2EGFPhBMP2并观察其对人牙龈成纤维细胞表型的影响.方法：采用RTPCR方法从人成骨肉瘤细胞中克隆hBMP2基因，连接T载体并测序正确后与真核表达载体pIRES2EGFP连接，酶切鉴定后转染入HEK293细胞中，利用荧光显微镜和P2后对人牙龈成纤维细胞增殖特性、ALP活性、OC含量、体

4、外矿化能力的影响.结果：成功克隆了人BMP2基因，酶切鉴定及测序均正确，真核表达载体pIRES2EGFPhBMP2能正确表达hBMP2蛋白，hBMP2对人牙龈成纤维细胞增殖特性无影响，但可增强其ALP活性、OC含量及体外矿化能力.结论：构建了hBMP2基因的真核表达载体pIRES2EGFPhBMP2，该基因可促进人牙龈成纤维细胞向成骨细胞方向分化.　　【关键词】牙龈；成纤维细胞;骨形态发生蛋白质2;转染;成骨细胞　　0引言　　人骨形成蛋白2（hBMP2）是骨形成蛋白BMP家族中诱骨活性最强的一种，也是唯一能单独诱导成骨的因子，在牙周组织再生和修复中具有重要的作用.本研究我们克隆

5、了hBMP2基因，并成功构建了真核表达载体pIRES2EGFPhBMP2，并观察其对人牙龈成纤维细胞生物学特性的影响，为将其应用于牙周组织工程的种子细胞奠定基础.　　1材料和方法　　1.1材料人成骨肉瘤细胞由第四军医大学唐都医院骨科郑联合博士惠赠.DNaseⅠ,DEPC购自Sigma公司，RNA提取试剂（TRIzol）购自GibcoBRL公司，RTPCR反应试剂盒,Lipofectamine2000,G418购自Promega公司，引物由北京赛百盛公司合成，质粒提取试剂盒和PCR产物胶回收试剂盒购自上海华舜生物技术公司，TaqDNA聚合酶,DNAmarkerDL2000,琼脂糖

6、、核酸内切酶EcoRⅠ,XhoI购自大连宝生物工程公司，去离子甲酰胺购自Amersham公司，IPTG,Xgal,pGEMTeasy载体为Promega公司产品，pIRES2EGFP真核表达载体购自BiosciencesClontech公司.JM109菌种由本实验室保存.　　1.2方法　　1.2.1hBMP2基因的克隆TRIzol法提取总RNA后反转录为cDNA.hBMP2上游引物：5′CTCGAGGGTCTCCTAAAGGTCGACCATGGTG3′，下游引物：5′GAATTCTCACTTGTCATCATCGTCCTTGTAGTCGCGACACCCACAACCCTCCACAAC

7、3′，其中下划线分别为XhoI和EcoRI酶切位点，阴影部分为Flag标签序列，所扩增片段的长度为1190bp.PCR反应条件：94℃,5min，94℃,30s，53℃,60s,72℃,60s，35个循环，72℃,5min.琼脂糖凝胶电泳后回收PCR产物，与pGEMTeasy连接后转化JM109感受态，铺氨苄抗性的LB平板，挑克隆摇菌.提质粒后用XhoI,EcoRI双酶切鉴定和测序鉴定.　　1.2.2真核表达载体pIRES2EGFPhBM