pIRES2―NGF―NT―3真核表达载体的构建与鉴定

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1、PIRES2-NGF-NT-3真核表达载体的构建与鉴定摘要：构建双基因共表达载体PIRES2-NGF-NT-3并检测其在HEK293细胞中的表达。人神经生长因子(nervegrowthfactor,NGF)和神经营养素3(neurotrophin-3,NT-3)是采用直接PCR的方法从人外周血单个核细胞的基因组DNA中获取，将人神经生长因子的cDNA片段插入到PIRES2-EGFP多克隆位点构建成为pIRES2-NGF-EGFP神经营养素3cDNA片段通过替换绿色荧光蛋白基因(EGFP)的方式插入到p

2、IRES2-NGF-EGFP中构建成为pIRES2-NGF-NT-3双基因共表达载体，将pIRES2-NGF-NT-3用脂质体转染HEK293细胞并采用RT-PCR与Western-blot的方法检测其表达。人神经生长因子和神经营养素3被克隆，通过测序和酶切鉴定的得知与基因库报道序列一致。pIRES2-NGF-NT-3转染HEK293细胞后双基因在mRNA和蛋白水平均得到了表达。人神经生长因子和神经营养素3双基因真核表达载体成功构建，它提供了一个新的表达系统，为进一步研究双基因的功能奠定了基础。关键词

3、：人神经生长因子；神经营养素3；真核双表达裁体；内部核糖体进入位点中图分类号:Q812文献标识码：A文章编号：1007-7847(2014)04-0315-08外伤性脊髓损伤发生率比较高，一般都会导致严重的神经系统损害。中枢神经系统损伤的恢复是相当困难的，因为受伤的中枢神经系统，其细胞与髓鞘再生以及重建功能性神经连接的能力有限。随着干细胞技术的发展，增加轴突再生的治疗策略之干细胞向受损脊髓部位的移植研究越来越广泛。间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)被认为是一个很好来源的

4、干细胞，由于巨大的自我更新和多谱系分化潜能。使用间充质干细胞治疗缺血性脑损伤的动物实验中，其疗效已经得到证实。人类骨髓细胞在治疗血液病方面有着悠久的历史。此外，非造血干细胞，如骨髓间充质干细胞(MSCs),却可以分化成成熟的骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞。研究发现，骨髓细胞(骨髓间充质干细胞)在特定的实验条件下可以诱导分化为成熟的神经元或神经胶质细胞。这些发现为骨髓间充质干细胞应用于神经性疾病患者的治疗增加了可能性，这也避免了使用胚胎干细胞而带来的伦理问题。在组织工程研究中，采用基因修饰的方法来提高干细胞

5、的增值和定向分化的能力一直是研究的热点领域。神经生长因子、神经营养因子-3脑源性神经营养因子或衍生的支架或在这些因素的基础上构建的表达载体在动物实验研究中得到了广泛的使用，并逐渐应用于临床研究。本研究旨在通过一种简单和有效的方法构建一个双基因的真核表达载体PIRES2-NGF-NT-3，为进一步研究NGF（nervegrowthfactor）与NT-3（neu-rotrophin-3）这两个基因的协同功能奠定基础。1材料与方法1.1实验材料PIRES2-EGFP购自北京天恩泽基因科技有限公司（中国）；

6、人外周血单个核细胞取自健康捐献者，已签署知情同意书；E.coli菌株DH5a、HEK293T细胞株为本实验室保存;T4DNA连接酶、TaqDNA聚合酶、XhoI、BamHI、NotI、BstXI限制性内切酶、总RNA的提取试剂盒、逆转录试剂盒、高纯度凝胶提取试剂盒、DNAmarker均购自购自宝生物工程大连有限公司（中国）;Tri-zolReagent和转染试剂脂质体2000购自Invitro-gen公司（美国）；DMEM培养基与新生牛血清、胰蛋白酶为购自Gibco公司（美国）；质粒小提试剂盒购自Sa

7、ngon公司（中国）；NGF与NT-3抗体一抗购SantaCruz公司（美国）；引物由上海生物工程技术服务有限公司合成（中国）。1.2引物的设计与合成NGF（NM_002506.2）和NT-3（NM_0011026-54.1）在基因库中的基因序列用来作为模板设计引物（见表1）。人神经生长因子（NGF基因片段的核心编码序列完全的基因组DNA的外显子3上。两条特异性的引物被设计用于从外显子3上扩增出人神经生长因子。XhoI限制性内切酶切割位点和保护性碱基添加在上游引物，在下游引物中加入BamHI限制性内切

8、酶切割位点和保护性碱基，扩增片段长度为726bpo接着设计了两对引物来扩增人类神经营养因子3O长的正向引物在5'末端比短的正向引物多出来4个碱基。与此类似,反向长引物序列比反向短引物序列也多出来4个碱基，我们通过双PCR的方法在正向引物序列中引入了BstXI粘性末端一部分，而在反向引物序列中引入了NotI粘性末端一部分，这将用于组装BstXI位和NotI粘性末端，扩增片段长度为774bpo1.3pIRES2-NGF-EGFP表达载体的构建人外周血单核细胞