pires2egfphbmp2载体的构建及对人牙龈成纤维细胞表型的影响论文

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1、pIRES2EGFPhBMP2载体的构建及对人牙龈成纤维细胞表型的影响论文唐昊喆，王勤涛，董广英，马志伟，丁敖，李长春，孙迎春，王莉【Abstract】AIM:ToconstructandidentifytheeukaryoticexpressionvectorpIRES2EGFPhBMP2anhBMP2andtoobserveitseffectsonthephenotypeofhumangingivalfibroblast.METHODS:hMBP2genehumanosteogenicsarabyRTPCRandinsertedin

2、toTvector.AfterDNAsequencingverification,iticroscopeandP2ontheproliferation,ALPactivity,contentofOCandtheexvivomineralizationcapacityoffibroblastbyMTT.RESULTS:HumanBMP2geneangingivalfibroblastbutincreasedtheALPactivity,OCcontentandexvivomineralizationcapacity.CONCLUSION:Thee

3、ukaryoticexpressionvectorpIRES2EGFPhBMP2expressinghBMP2isconstructedsuccessfullyandthisgenepromoteshumangingivalfibroblasttodifferentiatetoorphogeicprotein2;transfection;osteoblasts【摘要】目的：构建hBMP2基因的真核表达载体pIRES2EGFPhBMP2并观察其对人牙龈成纤维细胞表型的影响.方法：采用RTPCR方法从人成骨肉瘤细胞中克隆hBMP2基因.f

4、reela公司，RNA提取试剂（TRIzol）购自GibcoBRL公司，RTPCR反应试剂盒,Lipofectamine2000,G418购自Promega公司，引物由北京赛百盛公司合成，质粒提取试剂盒和PCR产物胶回收试剂盒购自上海华舜生物技术公司，TaqDNA聚合酶,DNAmarkerDL2000,琼脂糖、核酸内切酶EcoRⅠ,XhoI购自大连宝生物工程公司，去离子甲酰胺购自Amersham公司，IPTG,Xgal,.freelega公司产品，pIRES2EGFP真核表达载体购自BiosciencesClontech公司.JM109菌

5、种由本实验室保存.1.2方法1.2.1hBMP2基因的克隆TRIzol法提取总RNA后反转录为cDNA.hBMP2上游引物：5′CTCGAGGGTCTCCTAAAGGTCGACCATGGTG3′，下游引物：5′GAATTCTCACTTGTCATCATCGTCCTTGTAGTCGCGACACCCACAACCCTCCACAAC3′，其中下划线分别为XhoI和EcoRI酶切位点，阴影部分为Flag标签序列，所扩增片段的长度为1190bp.PCR反应条件：94℃,5min，94℃,30s，53℃,60s,72℃,60s，35个循环，72℃,5min.琼脂

6、糖凝胶电泳后回收PCR产物，与pGEMTeasy连接后转化JM109感受态，铺氨苄抗性的LB平板，挑克隆摇菌.提质粒后用XhoI,EcoRI双酶切鉴定和测序鉴定.1.2.2真核表达载体pIRES2EGFPhBMP2的构建及表达鉴定将质粒pGEMhBMP2和pIRES2EGFP分别用EcoRI和XhoI进行双酶切，胶回收hBMP2片段和线性化的pIRES2EGFP载体，将片段和载体连接后用XhoI,EcoRI双酶切鉴定，所得正确的重组质粒命名为pIRES2EGFPhBMP2.用Lipofectamine2000将其转染入人胚肾293

7、细胞中，24h后荧光显微镜恶和EM培养.实验前用波形丝蛋白和角蛋白抗体染色，鉴定细胞起源.第5代细胞用于转染.将pIRES2EGFPhBMP2转入人牙龈成纤维细胞内.48h后，换入含350mg/LG418的DMEM（100mL/L的FBS），筛选2L，混匀后室温放置20min，4℃3500r/min离心20min，弃上清，检测沉淀物的放射剂量.1.2.6矿化结节形成实验取转染后第5代和未转染细胞，以5×104/孔的密度接种于放有盖玻片6孔板，每组接种3孔（每孔玻片3张）.24h后加入矿化液（10mmol/Lβ甘油磷酸钠,50mg/LβVit

8、C和10-8mol/L地塞米松），每3d换液1次，连续培养21d.取出盖玻片，以4g/L中性甲醛固定，采用vonKossa染色法进行染色