nfκb及其相关炎性因子致大鼠移植肝冷保存损伤的机制

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1、NFκB及其相关炎性因子致大鼠移植肝冷保存损伤的机制：蒋安，刘峰，刘昌，宋宇龙，孟珂伟，吕毅蒋安【摘要】目的通过大鼠移植肝在不同冷保存时间再灌注后核因子κB(nucleartranscriptionfactorκB,NFκB)及其相关炎性因子的激活情况，判断冷保存时间、NFκB激活以及移植肝功能损伤三者之间的联系。方法用ethodsOrthotopiclivertransplantationedinSA)按YANG等[8]的方法提取肝组织的核蛋白，-70℃冻存备用，用考马斯亮蓝蛋白浓度检测试剂盒(南京建成生物工

2、程研究所产品)测定蛋白浓度。结合NFκB的寡核苷酸探针(上海生工生物工程技术有限公司合成)双链核苷酸序列为5′AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC3′，3′TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG5′，以γ32PATP(北京福瑞生物工程公司产品)进行探针标记。室温下将2μL5×凝胶滞留结合缓冲液、核蛋白10μg、鲑精DNA(4g/L)1μL混匀，10min后加入γ32PATP标记的NFκB探针2μL，反应30min后加入5×上样缓冲液2μL，60g/L非变性聚丙烯酰胺凝胶恒压电泳2h(11

3、0V)后，-70℃放射自显影6h。X光片置于BIORAD凝胶图象分析系统测定NFκB活性值(A值)来表示提取物中NFκB的DNA结合活性。NFκB活性值(A)=滞后带吸光度值(A)×滞后带面积值(S)。　　1.3.2冷保存期肝组织TNFα和IL1β的测定　　采用免疫组化SABC法在石蜡切片上测定TNFα和IL1β的表达。TNFα和IL1β主要定位于细胞质内，表现为胞质黄染或棕黄色颗粒。免疫组化染色结果判定参照MATTERN的方法[9]。阳性染色深度：未见染色为0，轻度染色(染成浅黄色)为1，中度染色(

4、染成棕黄色)为2，深度染色(染成棕褐色)为3；阳性细胞百分比：未见染色为0，染色细胞<25%为1，25%～50%为2，>50%为3。将这两方面得分相加，得分0～2分判为阴性表达，>2分(3～6)判为阳性表达。每组10例标本，每例标本随机选择10个高倍视野，记数100个细胞判定此例标本的表达为阳性或阴性，并计算阳性表达率。　　1.3.4再灌注后血清TNFα、IL1β的测定　　血清TNFα、IL1β采用双抗体夹心ELISA法，试剂盒购自晶美生物工程公司，采用德国FLUOstarOPTIMA高通量微板

5、测试系统测定。　　1.3.5再灌注后血清ALT、AST的检测　　采用日立生化分析仪7160，进行血清ALT、AST的检测。　　1.4统计学处理　　采用SPSS13.0软件，实验数据以均数±标准差(±s)表示。各组样本间均数用单因素方差分析比较，各组间阳性率用四格表的确切概率法比较。P<0.05为差异有统计学意义。　　2结果　　2.1大鼠肝移植模型的制备情况　　正式实验共进行大鼠肝移植手术30例，手术死亡3例，成功率90%。供体手术(18.6±5.2)min，供肝修整(8.5±3)min；受体手术(30.2±6.4)

6、min，无肝期(15.5±3.3)min。门静脉开放后，肝脏颜色迅速变红，并可以看到少量金黄色胆汁分泌。3h时存活受体大鼠可自行活动、饮水，满足获取标本需要。　　2.2肝组织冷缺血期和再灌注期NFκB的测定结果　　NFκB在B组和C组冷保存期均呈现不同程度活化，组间比较无统计学差异(P>0.05)。D组同其他冷保存组相比，NFκB活性显著增高(P<0.05)。再灌注后，B组、C组和D组NFκB活性均较假手术组活性水平增高(P<0.05)。随着冷保存时间的延长，NFκB活性增高(P<0.0

7、5，表1、图1)。表1不同冷保存时间组移植肝NFκB的活性（略）　　2.3冷保存期肝组织TNFα、IL1β的测定结果　　随着冷保存时间的延长，TNFα和IL1β在肝组织中的阳性表达率逐渐升高，D组TNFα和IL1β的阳性表达率较A、B、C组明显升高(P<0.05，表2)。表2不同冷保存时间肝组织TNFα及IL1β的表达（略）　　2.4再灌注期血清TNFα、IL1β及ALT、AST的测定结果　　再灌注后，B、C、D组TNFα和IL1β均较假手术组明显升高(P<0.05)，而且随着冷保存

8、时间延长，两种细胞因子活性均升高(P<0.05)。随着冷保存时间的延长，再灌注后血清转氨酶水平升高，组间比较差异有统计学意义(P<0.05，表3)。表3再灌注后血清TNFα、IL1β、ALT、AST水平和细胞凋亡指数(AI)的变化（略）　　2.5再灌注后肝细胞的凋亡情况　　凋亡细胞在TUNEL染色中显