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时间:2018-05-01
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1、α硫辛酸对糖尿病大鼠认知能力的影响【摘要】目的检测α硫辛酸对糖尿病大鼠认知能力的影响情况,探讨α硫辛酸对糖尿病大鼠学习与记忆影响的机制。方法orris水迷宫测试其学习记忆能力,er’sdisease,AD)的发病率较非糖尿病患者增加2倍以上[2],糖尿病合并AD的患者脑萎缩程度明显重于单纯AD的患者[1];因此,糖尿病和AD已经成为医学和社会面临的严峻问题。虽然糖尿病是AD发病的重要危险因素之一,但对其具体的作用机制研究尚少。α硫辛酸(αlipoicacid,αLA)广泛分布于动植物等生物组织中,具有较强的抗氧化作用。有研究认为αLA可以改善糖尿
2、病鼠血糖和氧化应激水平[3]。此外,由于αLA生物组织易吸收利用,并能通过血脑屏障,对很多脑和神经衰退性疾病可能都有一定的防治作用。基于此,本研究以STZ诱导糖尿病大鼠模型,用αLA进行干预,旨在探讨αLA对于β淀粉样蛋白的沉积、海马神经元凋亡及对糖尿病大鼠认知功能障碍的影响,以期初步揭示αLA应用于糖尿病脑病认知功能障碍的治疗机制。 1材料与方法 1.1实验动物分组及建模方法清洁级近交系pH7.4的Tris缓冲液中),干预2周;正常对照组和糖尿病组同期给予等量Tris缓冲液(pH7.4),腹腔注射2周。 1.2组织标本采集和保存喂养16周后,摘
3、取心脏,锡箔纸包裹后保存于-80℃冰箱;Morris水迷宫检测学习记忆能力,TUNEL检测神经元细胞凋亡情况,的圆形水池中,设置直径约10cm、高15cm的平台,平台表面低于水面2cm,先通过4天的训练让大鼠熟悉并游至平台上。第5天隐藏平台,通过记录分析系统分析处理潜伏期,考察学习能力。第6天撤去平台,进行空间搜索实验——去除平台观察2min内大鼠在中心区停留时间百分比和通过原平台位置次数,测试记忆能力。 1.4in,待溴酚蓝至积层胶与分离胶交界处,换恒压100V电泳2h,使溴酚蓝全部电泳出分离胶底部。半干电转法将分离胶上的蛋白转移到经甲醇处理的PVDF膜上
4、(12V,30min)。膜用1×TBST溶液配制的5%脱脂奶粉(SIGMA公司)封闭12h,再加入分别以1/400和1/600稀释的NFκB兔抗鼠抗体(SANTACRUZE,北京中山生物技术有限公司分装,1/400稀释)以及以1/400稀释的兔抗鼠βactin抗体(SANTACRUZE,北京中山生物技术有限公司分装)于4℃孵育过夜,TBST清洗3×10min,加入1/1000HRP标记的羊抗兔IgG抗体(SANTACRUZE公司生产,北京中山生物技术有限公司分装)37℃摇床上以50r/min孵育60min,TBST清洗3×5min。用化学发光试剂盒(北京中
5、山生物技术有限公司)检测结合的辣根过氧化物酶标记的第二抗体,X线片显影,用Qualityone软件分析,以目的条带光密度/βactin光密度作为表达强度的定量指标。 1.5检测细胞凋亡将海马组织用PBS洗3次后于4%的多聚甲醛中固定25min,采用TUNEL法检测细胞凋亡情况,所用试剂盒为南京凯基生物有限公司提供。将用蛋白酶K消化后的切片用TUNEL液覆盖,37℃下孵育90min;SSC终止反应,抗HRP抗体常温孵育15min,PBS洗净,DAB呈色。光镜下凋亡细胞呈深浅不一的棕黄色。凋亡细胞半定量分析:根据凋亡细胞分布情况在400倍光镜下,每组切片拍摄7
6、个阳性视野,每个视野计数200个凋亡的细胞,以计算平均凋亡细胞数所占百分比作为凋亡指数。 1.6统计学方法全部数据采用均数±标准差(±s)表示,采用SPSS11.0统计分析软件进行OneWayANOVA分析检验,P<0.05为显著性差异有统计学意义。 2结果 2.1三组细胞胞核NFκB蛋白表达糖尿病组较之正常对照组核NFκB蛋白表达增加,有显著性差异(P<0.05)。α硫辛酸组较之糖尿病组核NFκB蛋白表达减少,有显著性差异(P<0.05),见表1。 2.2三组细胞浆TUNEL检测结果糖尿病组较之正常对照组TUNEL阳性细胞
7、增加,有显著性差异(P<0.05)。α硫辛酸组较之糖尿病组TUNEL阳性细胞减少,有显著性差异(P<0.05),见表1。 表1各组海马神经元凋亡率及NFκB蛋白表达比较(略) a:P<0.05,与正常对照组比较;b:P<0.05,与糖尿病组比较 2.3隐藏平台获得实验糖尿病组较之正常对照组潜伏期增加,有显著性差异(P<0.05)。α硫辛酸组较之糖尿病组潜伏期缩短,有显著性差异(P<0.05)(见表2)。 2.4空间搜索实验糖尿病组较之正常对照组中心区停留时间百分比和通过原平台位置次数较明显下降(P<0.0
8、5),α硫辛酸组较糖尿病组明显增加(
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