hela细胞中hcvns5a的表达对干扰素敏感病毒vsv复制的影响

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1、HeLa细胞中HCVNS5A的表达对干扰素敏感病毒VSV复制的影响　　【Abstract】AIM:TodemonstratetheeffectofHCVNS5Aexpressiononvesicularstomatitisvirus（VSV）replication.METHODS:StablytransfectedcellsanrebinantIFNα2aedandsupernatantsepointsafterinfection.Changesininfectiousvirusyieldseasuredbyastandardvirusplaqueassayi

2、nVerocells.RESULTS:EM7.5g/L羧甲基纤维素钠(CMC)1mL.继续培养48h后移走培养液，结晶紫染色，自来水轻柔洗净，记录噬斑形成单位(PFU).结果：干扰素(IFN)浓度为1×105U/L，VSV对HeLaNS5A细胞的致病变作用要比对HeLaNS5AΔISDR细胞的致病作用更明显.在整个IFN浓度处理中，HeLaNS5A细胞培养液中的病毒滴度是HeLaNS5AΔISDR细胞培养液中的病毒滴度的2~5倍(P<0.05).结论：NS5A能增强IFN敏感病毒的复制，HCVNS5A内的ISDR可能是造成IFN对HCV患者治疗效果的因素

3、.　　【关键词】丙型肝炎病毒;非结构蛋白5A;干扰素敏感决定区;水泡性口炎病毒;空斑形成单位　　　0引言　　干扰素(interferon,IFN)是目前治疗丙型肝炎最有效的药物，但治愈率不到30%.有人认为，NS5A内存在干扰素敏感决定区(interferonsensitivitydeterminingregion,ISDR)，影响IFN的抗病毒疗效.在临床研究中，丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus，HCV)NS5A对IFN抗病毒治疗具有固有抗性的观点仍有争论.NS5A可利用所谓的ISDR外的序列来干扰或逃避IFN诱导的抗病毒效应,宿主介导的压力选择

4、主要作用在NS5A的C端［1］，但是Mangoni等［2］认为ISDR的上游变异性与IFN治疗应答有关.另外，NS5A可能与2′,5′寡腺苷酸合成酶(25OAS)相互作用，以ISDR非依赖机制抑制IFN的抗病毒活性［3］.为了进一步探明HCVNS5A中是否存在影响IFN治疗的结构域，在已经成功构建的稳定转染HeLaNS5A和HeLaNS5AΔISDR细胞系的基础上，我们利用对IFN敏感的病毒水泡性口炎病毒(vesicularstomatitisvirus,VSV)，在IFN存在的条件下通过对比分析VSV在这两株细胞系中复制的差异，探讨HCVNS5AISDR与I

5、FN疗效的相关性.　　1材料和方法　　1.1材料　　稳定转染的HeLaNS5A和HeLaNS5AΔISDR细胞系由第四军医大学基础部微生物学教研室构建;VSV病毒由第四军医大学生物技术中心提供(5×1010PFU/L);Vero细胞由本室保存;胰蛋白酶购于宝生物工程(大连)有限公司;DMEM和HEPES购自Invitrogen公司;结晶紫购自湖南化学试剂公司;羧甲基纤维素钠(CMC，中等黏度，分析纯)购自天津市科密化学试剂开发中心;小牛血清购于中美合资兰州民海生物工程有限公司;人基因工程α2a型干扰素(rHuIFNα2a)购自第四军医大学生物技术中心(1×10

6、7U/支).　　1.2方法　　称取1.5gCMC，溶于100mL三蒸水中，高压灭菌.将配好的100mL2×DMEM移入盛有100mL15g/LCMC的玻璃瓶中混匀，然后加入22mL小牛血清，此即为含100mg/L小牛血清的DMEM7.5g/LCMC溶液.称取5g结晶紫，溶于100mL无水乙醇，此即为50g/L结晶紫贮存液.待使用时移取50g/L结晶紫贮存液8mL，8.5g/LNaCl30mL，甲醛2mL，混匀后即为10g/L结晶紫染色液.将IFN加入培养上清液至终浓度为1×105U/L，培养24h后，按感染复数(MOI)=1加入相应体积的VSV病毒贮存液.继续

7、培养36h后在倒置显微镜下观察VSV对稳定转染的HeLaNS5A和HeLaNS5AΔISDR细胞形态的影响.在6孔培养板中每孔加入稳定转染的HeLaNS5A和HeLaNS5AΔISDR细胞5×105个.培养24h后，加入rHuIFNα2a(0，2×104，1×105，3×105，6×105，1×106U/L).培养24h后按MOI=1加入VSV，继续培养24h和36h.取培养上清液稀释成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，取50μL稀释液加入24孔培养板中，每一处理均做3个平行孔.其中，24孔培养板中每孔已加入5×104个Ve

8、ro细胞，并已培养了24h.将24孔培