痤疮丙酸杆菌对小胶质细胞产生tnfα、il1β的影响

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1、痤疮丙酸杆菌对小胶质细胞产生TNFα、IL1β的影响【摘要】目的:探讨痤疮丙酸杆菌（P.aes）对小胶质细胞产生TNFα、IL1β的影响,明确外伤后细菌性致死性肉芽肿(FBGT)致病菌P.aes临床株、标准株刺激机体产生细胞因子的差别。方法:采用ELISA法、RTPCR的方法观察标准株、临床株对小胶质细胞产生TNFα和IL1β的影响。结果:(1)P.aes临床株和标准株均可促进小胶质细胞产生TNFα和IL1β,与空白对照组相比有统计学意义（P＜0.05）,标准株较临床株有较强的刺激小胶质细胞产生TNFα的能力;(2)临床株和标准株均能

2、促小胶质细胞进产生IL1β,二者差别无统计学意义,但产生IL1β的能力大于TNFα。结论:P.aes均可促进小胶质细胞产生TNFα、IL1β,但其能力不同,说明P.aes刺激机体早期免疫应答水平不同。【关键词】痤疮丙酸杆菌小胶质细胞IL1βTNFα　　外伤后细菌性致死性肉芽肿(fatalbacteriagranulomaaftertrauma,FBGT)是一种继发于面部外伤的慢性感染性致死性疾病［1］,目前已明确其病原菌为痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumaes,简称P.aes)［2］,且已证明从患者皮损内分离出的细菌并无

3、变异。P.aes是一种革兰阳性厌氧杆菌,属于一种低毒力细胞内寄生菌。FBGT患者均在皮损出现后1.5至4年内死于由P.aes导致的脑组织炎症。小胶质细胞（microglia,MG）是重要的免疫细胞,由其组成一个广泛的防御网,对神经元具有支持、营养作用［3］。MG作为脑内的抗原提呈细胞,表面有许多细胞因子受体和趋化性细胞因子受体,可产生多种细胞因子和趋化性细胞因子,能刺激T细胞活化及增殖,启动或促进炎症反应在中枢神经系统内的进程［4］。P.aes如何进入脑内、为何引起如此凶险的后果等一直是大家关注的问题,但相关研究目前是一片空白。而且对小胶质细胞产生细

4、胞因子功能的影响尚不明确,为了明确P.aes对单核巨噬细胞产生细胞因子的影响,我们采用ELISA法、RTPCR法观察P.aes作用于小胶质细胞后TNFα、IL1β的产生情况。　　1材料和方法　　1.1材料　　小胶质细胞株［ATCC(CRL2020),购于ATCC］,以含100mL/L胎牛血清（中国医学科学院生物工程研究所）的RPMI1640培养液、IL1βELISA试剂盒、TNFαELISA试剂盒购自美国Hyclone公司,在37℃、50mL/LCO2的孵箱中培养并传代;P.aes标准株(编号:NCTC737)由中国科学院微生物所刘志恒教

5、授惠赠:临床株来自患者皮损的分离;用厌氧脑心浸液肉汤(BHI)购自英国Oxiod公司培养。　　1.2方法　　1.2.1细胞培养　　小胶质细胞体外培养含100mL/L胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养,37℃、50mL/LCO2培养。　　1.2.2P.aes悬液的制备　　挑取单个菌落接种于厌氧脑心浸液肉汤培养基(BHI)中,37℃厌氧箱中静止培养,3d后,麦氏比浊法计数,用生理盐水稀释、调整细菌密度至1×1011/L,-20℃保存,使用前室温融化。　　1.2.3分组及细胞处理　　试验分组:按照菌株分为临床株和标准株作为实验组,生理盐水作为(空白对

6、照组)。细胞处理:收获培养4d的小胶质细胞,台盼蓝排除试验证明活细胞率在95%以上。将细胞密度调整为1×109/L,接种于24孔板,每孔1mL,分别加入各组菌悬液液1mL,37℃、50mL/LCO2孵育24h,800r/min离心6min,收集上清,-20℃保存,使用前室温融化。　　1.2.4ELISA法　　根据说明,试剂盒平衡至室温(20℃～25℃),配制工作液。加入100μL标准品、100μL标本与相应反应孔中,混匀30s,封板,37℃温育60min,洗板(用洗涤液洗涤反应板,去除水滴,反复5次),每孔加入100μL生物素,混匀30s,封板,37

7、℃温育60min,洗板5次,每孔加入100μL浓缩酶联物,混匀30s,封住板孔,37℃温育30min,洗板5次,每孔加入显色液100μL,37℃暗处温育15min,每孔加入终止液100μL,30min内在490nm处读A值。根据标准品绘制的标准曲线查出其浓度。　　1.2.5RTPCRRTPCR分析:用TRZ提取细胞总RNA,紫外分光光度仪DU800测总RNA的浓度及纯度。取1μg作为RT模板。RT反应体系20μL,反应条件按照Invitrogen(SuperScriptTMIIIreverseranscriptase)说明书。冰浴后进行PCR。P

8、CR反应体系25μL,TNFα、IL1β、GAPDH:39个循环(95℃60s,60℃60s,72℃60