th1-th2类细胞因子对哮喘大鼠脾淋巴细胞神经生长因子表达的影响

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1、Th1/Th2类细胞因子对哮喘大鼠脾淋巴细胞神经生长因子表达的影响：代继宏，王永红，何海霞【摘要】目的：初步探讨IL13和IFNγ对支气管哮喘大鼠脾淋巴细胞神经生长因子NGF表达的影响.方法：建立olecularResearchCenter；NGF的ELISA试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司.PE4500PCR热循环仪系美国Sigma公司出品；Avant30低温高速离心机和Du70全自动紫外分光光度计系美国Beckman公司出品.1.2方法1.2.1哮喘模型的建立每只大鼠腹腔内注射抗原液1mL(其中含鸡

2、卵蛋白100mg，灭活百日咳杆菌疫菌5×109个和氢氧化铝干粉100mg)致敏，2in激发哮喘，观察症状，连续2L/L乙醇的烧杯中浸泡2～3min后置超净工作台上，用无菌眼科剪和眼科组织弯钳取脾，并置于盛有冷DHanks液(10mL)培养皿中的筛网上，剪成2～3段，用2mL注射针芯捻碎.将细胞悬液移入10mL离心管中，离心(1500r/min×5min)，弃上清后加入6mLTrisNHCl破坏红细胞，用吸管吹打混匀后室温下放置5min，离心(1500r/min×5min)，弃上清，DHanks液重悬细胞；取

3、5mLFieollHypaque分层液(比重为1.087)于另一离心管底部，将细胞悬液轻铺分层液表面离心（400r/min×20min），吸取单核细胞层；DHanks液洗涤细胞3次，加RPMIl640培养液10mL悬浮细胞，将脾单核细胞悬液移入培养皿中，置37℃培养箱中贴壁1h，使单核/巨噬细胞黏附于玻璃壁上，用毛细吸管吸出未贴壁的淋巴细胞悬液.取100μL脾淋巴细胞悬液稀释后用0.4g/L的台盼蓝染色，计数并观察细胞活力；调整脾细胞浓度为5×1010/L.1.2.2.2脾淋巴细胞培养孵育及干预脾淋巴细胞以

4、终浓度5×1010/L的密度接种于24孔培养板中，培养在含有100mL小牛血清、青霉素、链霉素各1万U／L，ConA为10kg/L的1640细胞培养基中，每孔细胞总体系均为1mL，置于37℃，50mL/LCO2的培养箱中培养.不同时间干预实验：分为IL13组(含IL13终浓度为50μg/L)、IFNγ组(IFNγ终浓度为10μg/L)、空白对照组(仅含上述培基)，每组20个复孔.分别于细胞培养0，12，24，36，48h时各留取4孔标本检测.不同浓度干预实验：IL13干预组浓度分别为10μg/L(低浓度

5、亚组)，50μg/L(中浓度亚组)，100μg/L(高浓度亚组)［4］；IFNγ干预组浓度分别为1μg/L(低浓度亚组)，10μg/L(中浓度亚组)，50μg/L(高浓度亚组)［7］；两组采用同一空白对照组，即IL13和IFNγ浓度均为0μg/L，每组设4个复孔，7组共28孔，刺激24h留取标本.标本离心后细胞沉淀用于半定量检测NGFmRNA.1.2.2.3RTPCR方法检测脾淋巴细胞NGFmRNA表达按照GenBank序列设计引物［5］：NGF上游引物，5′TCCAGGTGCATAGCGTAATG3

6、′，下游引物，5′CTCCGGTGAGTCCTGTTGAA3′，扩增片段为376bp；βactin上游引物，5′ACCCACACTGTGCCCATCTAT3′；下游引物，5′GGACTCATCGTACTCCTGCTTG3′，扩增片段为618bp.使用Trizol试剂从脾淋巴细胞中抽提总RNA.2μgRNA经Oligo(dT)引物和AMV逆转录酶合成cDNA.2μLcDNA样品加入10×PCR标准缓冲液2.5μL，10mmol/L的dNTPs0.5L，10μmol/L上下游引物各1μL，25mmol/

7、L氯化镁(MgCl2)2μL，1万U/μLTaqDNA聚合酶1μL，加DEPC至总反应体系25μL.PCR反应条件：94℃5min，94℃30s，52℃45s，72℃1min，共35个循环，72℃延伸10min.扩增产物在15g/L琼脂糖凝胶中电泳后，将凝胶在EagleEyeII图像处理系统上分析出每个PCR扩增产物DNA带的A值，以βactinPCR产物的A值为内对照，NGF产物与βactin的A值的比值百分比(％)对NGFmRNA的含量行半定量分析.统计学处理：所有数据用SPSS11.5统计软件处理.实验

8、结果用x±s表示，多个样本均数比较采用方差分析，多样本均数间两两比较采用LSDt检验，P<0.05为有统计学差异.2结果2.1哮喘大鼠模型的建立大鼠在抗原激发30~60min后则可出现呼吸急促、腹肌收缩、轻度发绀、行动迟缓及反应迟钝等；肺组织病理示大鼠支气管管壁周围有较多淋巴细胞、嗜酸性粒细胞浸润，还可见支气管气道上皮脱落、杯状细胞增生、黏液栓增多等改变.2.2哮