草木犀石油醚提取物对nfκb和血红素氧合酶1表达的影响

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1、草木犀石油醚提取物对NFκB和血红素氧合酶1表达的影响：庞然,张淑玲,赵雷,刘双林,董继华,陶君彦【摘要】目的:探讨草木犀的石油醚提取物在炎症中的作用。方法:通过LPS干预RAelilotus)1年生或2年生草本植物,是临床用于抗炎的一种中草药。然而,草木犀产生抗炎作用的分子生物学机制还不明确。本实验中拟通过LPS刺激RAI1640、TRIzol购自Gibico公司;LPS(EscherichiacoliO111:B4)和MTT购自Sigma公司;HO1羊抗鼠多克隆抗体购自RDSystems公司;兔抗鼠

2、多克隆抗体NFκBp65IgG抗体购自SantaCruz公司;MMLV逆转录酶、dNTP购自Promega公司;SYBRGreen购自Biotium公司;Oligo(dT18)及引物由Invitrogen公司合成。草木犀于2006年8月在陕西陇县采集,经陈科力教授（湖北中医学院）鉴定后保存于湖北中医学院药学部的植物样本库中。小鼠巨噬细胞系RAI1640培养液将其稀释成3种浓度10mg/L、5mg/L和1mg/L备用。1.2.2细胞培养小鼠巨噬细胞系RAI1640培养液（加入100U/mL青霉素,100m

3、g/L链霉素和100mL/L胎牛血清）,50mL/LCO2培养箱中37℃培养。1.2.3细胞模型的建立和干涉LPS处理前24h将细胞接种于6、24或96孔板上,24h后细胞贴壁后弃上清,加入含LPS10g/L的培养液和不同浓度的提取物,作用不同时间后收集细胞,分别使用免疫细胞化学法,实时荧光定量RTPCR法,)0.5g/L作阳性对照;(2)阴性对照组:黄芪多糖(APS)100mg/L作为阴性对照;(3)空白对照组:只用10g/L的LPS处理而不加药物干预;(4)正常对照组:不用LPS处理也不加药物干预。1

4、.2.5药物细胞毒性的检测用MTT法,在终止细胞培养前4h加入20μLMTT溶液（浓度5g/L,pH7.4）,终止细胞培养后每孔加入150μLDMSO,Spectramax250全自动定量绘图酶标仪测定A490值。细胞病变效应（cytopathiceffect,CPE）检测,细胞在提取液中培养24h后在显微镜下观察细胞形态以检测细胞病变。1.2.6NFκB的检测利用免疫细胞化学法(SP)检测NFκB的表达及分布变化。将盖玻片置于培养板中,并将细胞接种于培养板,待细胞爬片后,药物干预细胞2h。PBS洗涤,

5、4℃丙酮固定10min;30mL/L过氧化氢甲醇溶液孵育20min以封闭内源性过氧化物酶;10mL/LTritonX10037℃5min,PBS洗涤;加入山羊血清室温孵育20min;然后加入兔抗鼠多克隆抗体NFκBp65IgG抗体（1∶200）,4℃冰箱过夜,PBS洗涤;加入二抗（生物素化羊抗兔IgG,1∶400）,37℃30min,PBS洗涤;加入HRP结合链霉亲合素（1∶400）,37℃30min,PBS洗涤;DAB/H2O2显色,苏木素衬染,常规脱水、透明、封片。1.2.7血红素加氧酶1mRNA水

6、平的检测实时荧光定量RTPCR法检测HO1的基因表达。细胞干预18h后提取RNA检测HO1的基因表达量。细胞总RNA提取采用TRIzol试剂提取法,具体方法参照说明书。将RNA保存在-80℃备用。采用ABI7700序列检测仪。引物序列:MusHO1:Forin,细胞刮刮下并收集裂解液,10000r/min4℃10min,取上清保存于-20℃。用BCA法测定蛋白质浓度,取相同量蛋白质用于100g/LSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳;转移至硝基纤维素膜50g/L脱脂奶粉溶液37℃封闭1h;羊抗鼠HO1多克

7、隆抗体(1∶200),4℃孵育过夜,洗膜;应用辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶200）室温孵育1h,再加入化学发光显色剂显色,X光片曝光显影,凝胶成像分析系统扫描,pro3.0软件半定量分析。1.2.9统计学分析应用SPSS12.0统计分析软件包,采取单因素方差分析对实验数据进行处理,以P<0.05为有统计学意义。2结果2.1药物对细胞的毒性MTT实验结果显示3种浓度（10mg/L、5mg/L和1mg/L）药物干预细胞24h后对细胞活性没有明显影响。CPE结果亦如此（图1）。2.2药物对NFκB的抑制

8、效果免疫细胞化学法结果显示:药物干预时,胞质被染成棕色（图2A～C）,DM干预时,胞质被染成棕色（图2D）,表示NFκB多分布在胞质未被激活;APS干预时,胞核被染成棕色（图2E）,仅有LPS干预时,胞核被染成棕色（图2F）,表示NFκB集中分布在细胞核表达增强,说明APS、LPS能诱导其向细胞核转位,使NFκB活化。2.3药物干预前后HO1的mRNA水平药物提取物干预后HO1水平明显升高,并且药物浓度