臭苜蓿根提取物对巨噬细胞血红素氧合酶1表达的影响

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1、臭苜蓿根提取物对巨噬细胞血红素氧合酶1表达的影响：李晓峰，董艳玲，郭远瑾，容琼文，李燕华，李吕力【摘要】目的：探讨血红素氧合酶1在LPS诱导急性炎症中的表达及臭苜蓿根提取物的干预作用。方法：通过脂多糖(LPS)干预RAethods:InflammatorycellmodelRNAandproteinofHemeoxygenase1(HO1)ePCRandelilotussuaveolensextracts;Inflammation;Macrophagecell;HO1　　HO1(heme

2、oxygenase1)是胆红素形成过程中的限速酶之一，亦称热应激蛋白32(HSP32),为可诱导型HO，分子量为32kD,主要分布于单核巨噬细胞系统的微粒体中，在脑、脊髓、心、肝、脾、肺、胰、肠、皮肤、血管平滑肌以及内皮细胞中均有表达，在脾脏中活性最高[1]。HO1可在缺氧、缺血等多种应激状态下表达[2]。臭苜蓿根，豆科(Leguminosae)草木犀属(Melilotussuaveolens)1年生或2年生草本植物，是临床用于抗炎的一种中草药。臭苜蓿根产生抗炎作用的分子生物学机制还不明确。

3、本实验拟通过LPS刺激RAI1640、Trizol购自Gibico公司;LPS(EscherichiacoliO111:B4)和MTT购自Sigma公司;HO1羊抗鼠多克隆抗体购自RDSystems公司;MMLV逆转录酶、dNTP购自Promega公司;SYBRGreen购自Biotium公司;Oligo(dT18)及引物由Invitrogen公司合成。小鼠巨噬细胞系RAI1640培养基将其稀释成3种浓度10mg/L、5mg/L和1mg/L备用。　　1.2.2细胞培养小鼠巨噬细胞系RAI164

4、0培养液(加入100U/mL青霉素，100mg/L链霉素和100ml/L胎牛血清)，50mL/LCO2培养箱中37℃培养。　　1.2.3细胞模型的建立和干涉LPS处理前24h将细胞接种于6、24或96孔板上，24h后细胞贴壁后弃上清，加入含LPS10g/L的培养液和不同浓度的提取物，作用不同时间后收集细胞，分别使用实时荧光定量RTPCR法、)0.5g/L作阳性对照;(2)阴性对照组：黄芪多糖(APS)100mg/L作为阴性对照;(3)空白对照组：只用10g/L的LPS处理而不加药物干预;(4)正

5、常对照组：不用LPS处理也不加药物干预。　　1.2.5药物细胞毒性的检测MTT法，在终止细胞培养前4h加入20LMTT溶液(浓度5g/L，pH7.4)，终止细胞培养后每孔加入150μLDMSO，Spectramax250全自动定量绘图酶标仪测定A490值。细胞病变效应(cytopathiceffect，CPE)检测，细胞在提取液中培养24h后在显微镜下观察细胞形态以检测细胞病变。　　1.2.6血红素加氧酶1(HO1)mRNA水平的检测实时荧光定量RTPCR法检测HO1的基因表达。细胞干预1

6、8h后提取RNA检测HO1的基因表达量。细胞总RNA提取采用TRIzol试剂提取法，具体方法参照说明书。将总RNA保存在-80℃备用。RTPCR在ABIPrime7700SequenceDetectionSystem进行。引物序列：MusHO1:Fore7700SequenceDetectionSystem自带软件对数据自动分析后,用所给Ct值应用公式Folds=2ΔΔCt进行基因表达差异分析[4]。　　1.2.7HO1蛋白水平的检测in，使用细胞刮刮下并收集裂解液，10000rpm4

7、℃离心10min，取上清保存于-20℃冰箱。用BCA法测定蛋白质浓度,取相同量蛋白质用于100g/LSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳;转移至硝基纤维素膜，50g/L脱脂奶粉溶液37℃封闭1h;加入羊抗鼠HO1多克隆抗体(1∶200)，4℃孵育过夜，洗膜;应用辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶200)室温孵育1h，再加入化学发光显色剂显色,X光片曝光显影,凝胶成像分析系统扫描，pro3.0软件半定量分析。　　1.3统计学处理　　应用SPSS12.0统计分析软件包，采取单因素方差分析对实验数据进行处理，以P&l

8、t;0.05表示差异有统计学意义。　　2.3药物干预前、后HO1的蛋白水平　　ainesMD.Thehemeoxygenasesystemanditsfunctioninthebrain[J],CellMolBiol,2000,46(3):573585.　　2OtterbeinLE,ChoiAMK.Hemeoxygenase:colorsofdefenceagainstcellularstress[J].AmPhysiolCellMolPhysiol,2000,279:L102