rna介导abce1基因沉默对肺癌细胞95d增殖、凋亡的影响

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1、RNA介导ABCE1基因沉默对肺癌细胞95D增殖、凋亡的影响【关键词】SiRNA；ABCE1基因；转染第一：郑毛根(1966)，男，博士，副主任医师，主要研究肺癌的早期诊断与治疗。ABCE1基因是保守的ABC基因家族中最保守的基因之一，Chen等最近报道，ABCE1基因在脊椎动物的翻译起始中起重要作用，而翻译作为肿瘤的发生、发展过程中起相当重要的作用〔1〕。近期发展起来的RNA干扰技术具有几乎无细胞毒性、稳定性强、高效特异抑制靶基因等特点，为特异地抑制目的基因表达提供了有效的方法。本实验拟利用ABCE1特异性SiRNA表达载体转染肺

2、癌细胞系95D，评价其对95D细胞生长的抑制作用，并评价其对增殖、凋亡相关信号转导通路表达的影响，推测ABCE1基因对肺癌细胞95D的转移、浸润能力，为利用研究ABCE1与肺癌转移的相关性提供实验依据。　　1材料与方法　　1.1材料　　人肺腺癌细胞株95D购自中科院上海细胞所。3种ABCE1基因的SiRNA质粒(Si1,Si2,SiN)均为本课题组前期实验所构建。1640培养基、10%胎生小牛血清购于Hyclone公司。G418(GibcoBRL)购自北京中山生物工程公司；转染试剂FUGENE6和ELISA试剂盒购自R

3、oche公司(USA)，MTT购自Sigma公司(USA)。细胞培养板6孔板、24孔板、96孔板购自北京中山生物技术有限公司。　　1.2方法　　1.2.1NSCLC细胞株培养　　冻存细胞95D经复苏后，37℃、5%CO2条件下培养于含有10%胎牛血清的1640培养基(含浓度为100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素中，待80～90%细胞融合后胰酶消化传代。经3次传代稳定后，进行如下实验。　　1.2.2G418筛选浓度确定　　在12孔细胞培养板中，95D细胞,按1.5×105/孔细胞接种，加10%FBS的1640培养基1ml培养

4、，至细胞密度达到80%～90%左右，分别加入G418(新霉素)，使G418筛选浓度依次为将每孔中的G418浓度稀释至50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100μg/ml等12个级别，培养10～14d。每3天换液1次，维持培养孔中G418筛选浓度不变，显微镜观察细胞的生长状况，以第8～14天能杀死孔内所有细胞的G418浓度确定为筛选浓度。　　1.2.3细胞分组及转染　　将对数生长的细胞按2×103浓度接种到6孔培养板中培养。于30%～50%细胞汇合度时(处于对数生长期)准备进行转染。

5、实验分为4组，分别为质粒Si1转染组、质粒Si2转染组、阴性序列转染组(质粒SiN组)及空白对照组(正常细胞N组)。转染按Roche公司非脂质体型转染试剂FuGENE6说明书操作。前3组内质粒与FuGENE6采用1∶6比例。48h后用含有600μg/mlG418的10%FBS培养基更换培养基，每2天更换一次，至转染后5d。用倒置荧光显微镜(IX71,Olympus)和图像分析系统(SPOTRFKE,USA)，直接观察基因沉默的效果。　　1.2.4TT法检测细胞增殖情况(按说明书操作)，酶联免疫检测仪测定各孔490nm吸光值(A)

6、。　　1.2.6组蛋白DNAELISA凋亡检测　　收集转染后72、96、120h的上述三组细胞，按细胞凋亡检测试剂盒说明书操作，尽快作比色分析(10～20min内)，用底物缓冲液作空白对照，以波长405nm，参考波长492nm进行检测。　　1.3统计学分析　　数据以x±s表示，以SPSS11.0统计软件处理，采用方差分析作差异的显著性分析。　　2.2，AllikmetsR.pletecharacterizationofthehumanABCgenefamily〔J〕.JBioenergetBiome，2001;33(6):4759.

7、　　4DeslogesN，RahausM，ManfredH.Varicellazostervirusdoesnotsignificantlyinducethecelldefencemechanismmediatedbythe25A/RNaseLpathmunol,2005;194(6):2531.　　5AllikmetsR，GerrardB，HutchinsonA,etal.CharacterizationofthehumanABCsuperfamily：isolationandmappingof21neMolGe,1996;5

8、(10):164955.　　6KarcherA,ButtnerK,MartensB,etal.XraystructureofRLI，anessentialtebiogenesisandHIVcapsidassembl