rna介导abce1基因沉默对肺癌细胞95d增殖、凋亡的影响论文

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1、RNA介导ABCE1基因沉默对肺癌细胞95D增殖、凋亡的影响论文【摘要】目的研究构建的ABCE1基因SiRNA表达质粒基因沉默效果，及其对95D肺癌细胞株增殖、凋亡能力的影响。方法运用转染试剂FuGENE6对3种不同的ABCE1基因SiRNA表达质粒在95D肺癌细胞中进行转染，并用G418筛选，荧光显微镜观察3种质粒的转染效果，收集转染细胞，计数转染细胞总数、运用MTT法检测细胞活力，用ELISA法检测细胞凋亡。结果①转染的细胞表达红色荧光蛋白，荧光显微镜结果表明,重组质粒转染效率达42.7%。②实验组的细胞增殖低于对照组、而细

2、胞凋亡高于对照组(P＜0.05)。结论ABCE1特异性siRNA可明显抑制ABCE1基因转录和表达,并能有效诱导95D细胞的凋亡,为下一步在体内利用Si1重组质粒沉寂ABCE1基因,促肿瘤细胞的凋亡提供实验基础。【关键词】SiRNA；ABCE1基因；转染第一郑毛根(1966).freela公司(USA)。细胞培养板6孔板、24孔板、96孔板购自北京中山生物技术有限公司。1.2方法1.2.1NSCLC细胞株培养冻存细胞95D经复苏后，37℃、5%CO2条件下培养于含有10%胎牛血清的1640培养基(含浓度为100U/ml青霉素

3、和100μg/ml链霉素中，待80～90%细胞融合后胰酶消化传代。经3次传代稳定后，进行如下实验。1.2.2G418筛选浓度确定在12孔细胞培养板中，95D细胞,按1.5×105/孔细胞接种，加10%FBS的1640培养基1ml培养，至细胞密度达到80%～90%左右，分别加入G418(新霉素)，使G418筛选浓度依次为将每孔中的G418浓度稀释至50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100μg/ml等12个级别，培养10～14d。每3天换液1次，维持培养孔中G418筛选浓度不变，

4、显微镜观察细胞的生长状况，以第8～14天能杀死孔内所有细胞的G418浓度确定为筛选浓度。1.2.3细胞分组及转染将对数生长的细胞按2×103浓度接种到6孔培养板中培养。于30%～50%细胞汇合度时(处于对数生长期)准备进行转染。实验分为4组，分别为质粒Si1转染组、质粒Si2转染组、阴性序列转染组(质粒SiN组)及空白对照组(正常细胞N组)。转染按Roche公司非脂质体型转染试剂FuGENE6说明书操作。前3组内质粒与FuGENE6采用1∶6比例。48h后用含有600μg/mlG418的10%FBS培养基更换培养基，每2天更换

5、一次，至转染后5d。用倒置荧光显微镜(IX71,Olympus)和图像分析系统(SPOTRFKE,USA)，直接观察基因沉默的效果。1.2.4TT法检测细胞增殖情况(按说明书操作)，酶联免疫检测仪测定各孔490nm吸光值(A)。1.2.6组蛋白DNAELISA凋亡检测收集转染后72、96、120h的上述三组细胞，按细胞凋亡检测试剂盒说明书操作，尽快作比色分析(10～20min内)，用底物缓冲液作空白对照，以波长405nm，参考波长492nm进行检测。1.3统计学分析数据以x±s表示，以SPSS11.0统计软件处理，采用方差分析作差异

6、的显著性分析。2结果2.1ABCE1SiRNA质粒载体转染的效果根据文献报道RNAiReadypSIRENDNRDsRedExpress载体在瞬时转染中可直接用来观察构建的shRNA的对目的基因封闭的效能，该质粒载体能表达一种在荧光显微镜下可观察到红色荧光蛋白〔2〕。显示在转染24h后在95D细胞中表达一种红色荧光蛋白，且在整个细胞中均匀分布，24h后明显,48～72h达高峰。经流式细胞仪观察表达DsRed阳性细胞可达42.70%(图1)。2.2，AllikmetsR.pletecharacterizationoftheh

7、umanABCgenefamily〔J〕.JBioenergetBiome，2001;33(6):4759.4DeslogesN，RahausM，ManfredH.Varicellazostervirusdoesnotsignificantlyinducethecelldefencemechanismmediatedbythe25A/RNaseLpathmunol,2005;194(6):2531.5AllikmetsR，GerrardB，HutchinsonA,etal.Characterizationofthehuman

8、ABCsuperfamily：isolationandmappingof21neMolGe,1996;5(10):164955.6KarcherA,ButtnerK,MartensB,etal.XraystructureofRLI