hsp65psa融合蛋白的体内外抗肿瘤活性研究

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1、HSP65PSA融合蛋白的体内外抗肿瘤活性研究：董博翰,吴秀丽,尹晓光,王莉,卫红飞,孙陆果,于永利,王丽颖【摘要】　　目的:研究热休克蛋白65(HSP65)前列腺特异性抗原融合蛋白在体外对人树突状细胞的活化作用以及在小鼠体内抑制PSA阳性肿瘤细胞生长的作用。方法:利用）检测和斑点杂交的方法对PcDNA3GFPPSA稳定转染的B16细胞进行鉴定;用HSP65PSA融合蛋白刺激来自于人外周血的未成熟树突状细胞,观察融合蛋白对树突状细胞的体外活化作用;用PcDNA3GFPPSA稳定转染的B16细胞种植C57BL/6小鼠,继而用HSP65PSA融合蛋白

2、来免疫小鼠以观察融合蛋白对PSA阳性B16肿瘤细胞生长的体内抑制作用。结果:检测和斑点杂交结果均显示PcDNA3GFPPSA转染的B16细胞转染情况良好。体外细胞实验显示,将HSP65PSA融合蛋白作用于人外周血树突状细胞后可以明显促进树突状细胞表面分子CD86的表达,其上调率为52.93%。动物体内实验显示,HSP65PSA融合蛋白可以明显抑制PSA阳性B16肿瘤细胞在小鼠体内的生长。10μg蛋白免疫组的肿瘤体积（4.91±5.21）与对照组（10.56±6.10）相比差异有统计学意义（P<0.05）。结论:HSP65PSA融合蛋白可以在体外活

3、化树突状细胞,在小鼠体内抑制PSA阳性B16肿瘤细胞的生长。HSP65PSA融合蛋白可能具有应用于PSA阳性肿瘤的免疫治疗作用。【关键词】HSP65PSA融合蛋白PSA阳性B16肿瘤细胞免疫治疗肿瘤生长抑制　　肿瘤的免疫治疗正越来越多的为人们所关注。但现在的免疫治疗仍然存在一定的问题。首先,免疫后的肿瘤抗原不能很好地激发机体的细胞免疫作用,限制了抗肿瘤治疗的效果;其次,肿瘤抗原的免疫原性差,使其不易被免疫系统识别,无法产生高效的免疫应答[1];另外,肿瘤抗原的特异性也较差,易产生毒副作用。研究发现热休克蛋白（heatshockprotein,HSP）可以激发树

4、突状细胞的交叉提呈能力引导外源性MHCI类肿瘤抗原表位进入细胞免疫途径,从而使外源性抗原诱导机体产生更为强大的抗肿瘤免疫作用[2,3]。而在众多肿瘤抗原中,前列腺特异性抗原（prostatespecificantigen,PSA）是一种主要表达在前列腺癌组织中的肿瘤特异性抗原,在正常的前列腺组织及其他组织中其表达量很少。这决定了PSA蛋白可以作为一种外源性肿瘤抗原应用于抗肿瘤的免疫治疗,将其免疫机体后所产生的抗肿瘤免疫作用将具有较高的特异性且副作用更小[4]。故我们利用基因工程的方法将结核杆菌的HSP65和人PSA的部分MHCI抗原表位连接在一起,并表达和纯

5、化出了HSP65PSA融合蛋白。本实验中对这种融合蛋白的性质进行了鉴定,并通过体外的细胞实验和体内的动物实验观察HSP65PSA融合蛋白的免疫激活活性以及其在小鼠体内抑制PSA阳性肿瘤细胞生长的作用。　　1材料和方法　　1.1材料HSP65PSA融合蛋白由本室自己表达纯化。羊抗人PSA单克隆抗体（mAb）购自Biodesign公司。HRP标记驴抗羊IgG购自北京鼎国生物技术有限公司。PcDNA3GFPPSA真核表达载体由本室构建,PcDNA3GFPPSA稳定转染的黑色素瘤细胞株（B16/PcDNA3GFPPSA）由本室建立。健康人浓缩白细胞于长

6、春市中心血站。淋巴细胞分离液由中国医学科学院生物工程研究所灏洋生物技术有限公司生产。6～8周龄的雄性C57BL/6小鼠购于北京维通利华实验动物有限公司。共聚焦显微镜购自日本奥林巴斯公司。流式细胞仪购自美国BD公司。　　1.2方法　　1.2.1对HSP65PSA融合蛋白进行DM培养液中,在37℃、50mL/LCO2孵箱中培养,细胞呈单层贴壁生长,每2～3d传代1次。培养瓶中生长状态良好的细胞可直接在共聚焦显微镜下观察绿色荧光。（2）FCM鉴定:将生长状态良好的B16/PcDNA3GFPPSA细胞用2.5g/L的胰酶消化,加入无血清IMDM制备单细胞悬液并调整

7、细胞数为1×105/mL,取500μL单细胞悬液,1×PBS洗2次,滤网过滤1次后进行FCM检测。（3）斑点杂交法鉴定:将生长状态良好的B16/PcDNA3GFPPSA细胞用2.5g/L的胰酶消化,加入无血清IMDM制备单细胞悬液并调整细胞数为2×109/L,离心收集细胞,加入100μL细胞裂解液,在沸水中煮5min,离心收集上清,以上清原液、原液2倍稀释、原液4倍稀释、原液8倍稀释4个浓度用负压泵抽滤在硝酸纤维素膜上,同时以相同的方法取未转染的B16细胞上清和HSP65PSA融合蛋白溶液分别作为阴性对照和阳性对照,点膜后的硝纤膜用50g/L脱脂奶粉（1×

8、PBS配制）4℃封闭过夜