远志糖蛋白提取、分离纯化及体内外抗衰老活性研究

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1、中图分类号论文编号学科分类号密级＠替树ＳｈａｎｘｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ硕士学位论文远志糖蛋白提取、分离纯化及体内外抗衰老活性研究ＳｔｕｄｉｅｓｏｎｔｈｅＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＩｓｏｌａｔｉｏｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＲａｄｉｘＰｏｌａｌａｅ，，ｙｇ－ｌｃｏｒｏｔｅｉｎａｎｄｉｔｓＡｎｔｉａｉｎａｃｔｉｖｉｔｉｎｖｉｖｏａｎｄｖｉｔｒｏｇｙｐｇｇｙ研究生姓名：张娟娟导师姓名：王颖莉教授、职称学科：中药学、专业名称研究方向：中药质量控

2、制及活性成分分析研究申请学位类型：科学学位二〇ｂ年五月二十二曰山西中医学院学位论文原创性声明本人郑重声明：，是个人在导师的指导下所呈交的学位论文，独立进行研究工作。除文中己经特别加以注明引用的内容外所取得的成果，本论文不含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果。对本文的研宄做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明并致谢。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。论文作者签名：＞〇ｒ年ｊ月＞＞日｜关于学位论文使用授权的声明本人完全了解山西中医学院有关保留使用学位论文的规定，同意学校保留或

3、向国家有关部门机构送交论文的复印件和电子版，允许被查阅和借阅。本人授权山西中医学院可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。（保密论文在解密后应遵守此规定）论文作者签名：论文导师签名：２獻｜年ｒ？月碎日山西中医学院2017届硕士学位论文中文摘要目的本研究以山西道地药材远志为对象，利用现代提取分离方法、仪器分析鉴定技术对远志糖蛋白类成分的提取工艺、分离纯化、结构表征及体内外抗衰老活性进行了系统的分析研究，并进一步从血清代谢组学的角度，对其发挥抗衰老活

4、性的代谢通路进行初步探索，以期为远志药材药效活性物质的研究开拓新的领域。方法以蛋白得率为评价指标，从pH值、温度、盐浓度、液料比、提取时间五个方面进行单因素试验，根据单因素试验结果，选取其中影响较大的三个因素，运用响应曲面方法考察远志糖蛋白的最佳提取工艺。以优选工艺得到的远志总糖蛋白（PG）为研究对象，考察不同剂量总糖蛋白对D-半乳糖致衰老小鼠的抗衰老作用，试验结束后，测定血清及脑组织中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）及丙二醛（MDA）等指标的变化情况，对总糖蛋白的抗衰老活性进行初步验证。采用DEAE-52离子交换层析和Sepha

5、dexG-25葡聚糖凝胶层析对总糖蛋白进一步分离纯化，以多糖和蛋白含量为指标绘制洗脱曲线，收集纯化后的糖蛋白纯品，经SDS-Page电泳法验证其纯度并测定其分子量，在此基础上，采用紫外光谱、红外光谱、氨基酸自动分析等方法对其结构组成进行初步表征。对糖蛋白纯品进行体外抗氧化活性评价，包括清除DPPH自由基能力、清除羟自由基能力以及FRAP总还原能力。在前期体内抗衰老试验的基础上，通过GC-MS气质联用技术，采用主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）、单变量统计分析（UVA）及差异化合物筛选、代谢通路分析等分析方法，筛选

6、血清中与抗衰老作用相关的代谢标记物，并匹配相应的抗衰老作用通路。结果采用pH=7.85的Tris-HCl（NaCl浓度0.1mol/L）缓冲液，以液料比8mL/g、温度33℃水浴提取1.5h条件下，蛋白得率最高，可达（5.96±0.045）%。总糖蛋白体内抗衰老试验结果显示，与空白组比较，模型组胸腺指数和脾脏指数均显著降低（P<0.05或P<0.01），血清和脑组织中SOD活力、MDA含量显著降低（P<0.05），血清中CAT活性极显著降低（P<0.01）。与模型组比较，高剂量组血清中SOD活力显著升高（P<0.05），脑组织中MDA含量极显著

7、降低（P<0.01），中、高剂量组血清中CAT活性极显著升高（P<0.01）。分离纯化结果表明，以DEAE-52为交换填料，采用不同离子强度的缓冲液进行分阶段洗脱，以缓冲液BufferD（pH=7.850.1mol/LTris-HCl缓冲液含0.3mol/LNaCl）洗脱出来的组分，其蛋白和多糖含量成峰型对称分布，经SDS-Page电泳法验证其为电泳纯纯度，分子量为36kD，经红外光谱检测，I山西中医学院2017届硕士学位论文-1该糖蛋白（PG-D）在3230、2930、1640、1550、1458、1030、898cm附近均表现出明显的蛋白和

8、多糖分子的特征吸收峰；紫外β-消除反应前后对比显示240nm处有吸收强度的变化，说明该糖蛋白中糖肽键类型为O-糖肽键；氨基酸自动分析结果显示，该糖蛋白