ne(mhs)纳米乳剂疫苗的抗肿瘤免疫学效应研究

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1、NE(MHS)纳米乳剂疫苗的抗肿瘤免疫学效应研究【摘要】目的:制备包裹有MAGE1Hsp70和SEA的复合抗原的纳米乳剂疫苗NE（MHS）（nanoemulsionencapsulatedMAGE1Hsp70/SEA）,评价其抗肿瘤免疫学特性。方法:采用磁力超声法制备纳米疫苗NE（MHS）,评价其粒径、包裹率及稳定性;NE（MHS）免疫动物,IFNγELISPOT和LDH杀伤实验检测疫苗激活机体特异性细胞免疫反应情况;肿瘤攻击实验检测纳米乳剂疫苗的抗肿瘤效应。结果:（1）成功制备出粒径为（20±5）nm的NE（MH

2、S）,其药物包裹率为87%,于4℃放置6个月后或3000r/min10min离心后无分层;（2）与其他组相比,NE（MHS）组小鼠脾淋巴细胞中分泌IFNγ的T细胞数量明显增多（P<0.05）,CTL对B16MAGE1的特异性杀伤作用明显增强;NE（MHS）组B16MAGE1肿瘤成瘤时间长、成瘤率低。结论:NE（MHS）纳米乳剂疫苗具有良好的理化性质,能够刺激机体产生强烈的MAGE1特异性的细胞免疫,能有效预防表达MAGE1的肿瘤细胞攻击,是一种很有希望的新型抗肿瘤疫苗。【关键词】纳米乳剂肿瘤疫苗MAGE

3、1Hsp70SEA肿瘤疫苗作为预防肿瘤患者术后复发和转移的有力手段,近年来已得到广泛的研究和应用。目前,已有多种疫苗进入临床试验阶段。但是由于肿瘤免疫反应的复杂性,肿瘤疫苗距成为治疗型疫苗并真正走向临床实际应用尚有距离。考量各方面因素、综合各设计方案,本实验拟在已有研究的基础上,对所构建的肿瘤基因工程纳米疫苗进一步改进,并研究其抗肿瘤免疫学特性,为疫苗走向临床前研究打下实验基础。　　1材料和方法　　1.1材料　　大豆油、poloxamer188、span80购自美国Gibco公司。C57BL/6小鼠由第四军医大学动物中心提

4、供。MAGE1Hsp70蛋白、SEA蛋白由本实验室表达纯化制备。转MAGE1基因的小鼠黑色素瘤细胞由本实验室叶菁博士构建。ELISPOT检测试剂盒购自法国DIACLONE公司。　　Cytotox96检测试剂盒购自美国Promega公司。　　1.2油包水型纳米乳剂NE（MAGE1/Hsp70+SEA,MHS）的制备　　采用磁力超声法。具体:1.0mg复合抗原（融合蛋白MAGE1/Hsp70与超抗原SEA按摩尔比100∶1混合）、80g/LSpan20、180g/LPluronic188和0.6mL大豆油,双蒸水调整体积为

5、2.5mL,混合均匀得到油相;在3000r/min磁力搅拌下,将油相逐滴加入7.5mL双蒸水水相中;将混合物移至真空高速剪切乳化机上,在0.7kpa真空下,23000r/min,高速剪切40min,温度控制在80℃以下;冰浴下40kHz超声5min,反复3次,即得到纳米疫苗（0.1g/L）。用0.22μm的滤膜过滤除菌后,于4℃保存。　　1.3NE（MHS）的性质鉴定　　1.3.1形态观察　　将制成的NE（MHS）100倍稀释于生理盐水中,取100μL滴于400目铜网上,1min后吸去上清,10g/L磷钨酸染色1min,自

6、然晾干后在透射电子显微镜下观察其形态。　　1.3.2粒径检测　　将采集的图象经计算机图象分析求得NE（MHS）的平均粒径。　　1.3.3包裹率及稳定性测定　　采用SephedexG100凝胶层析法,洗脱液为PBS,流速为0.5mL/min。取NE（MHS）1.0mL上柱,收集游离峰即为游离的MHS。将收集的游离MHS用分光光度计测定A280值。同时制备不同浓度的MHS标准蛋白样品,用分光光度计测定其光度值,并绘制浓度与光度值的标准曲线。以标准曲线为依据,计算出NE（MHS）中游离MHS的含量。包裹率按公式计算:包裹率=(

7、HS的总量,HS的量）。将制备的NE（MHS）置于4℃冰箱保存6个月后或3000r/min10min离心后,电镜观察纳米乳剂形态,明确其稳定性。　　1.4纳米乳剂蛋白疫苗的细胞免疫反应　　1.4.1动物的分组、免疫和小鼠脾淋巴细胞的分离与活化取4～6周龄的二级C57BL/6小鼠(H2b),雌雄不拘,体质量(18±2)g,随机分为6组,每组6只。分组情况为:(1)PBS对照组:PBS0.15mL/鼠;(2)NE（－）对照组:空白纳米乳剂0.15mL/鼠;(3)MAGE1Hsp70免疫组:注射MAGE1Hsp70融合蛋白

8、14μg（150pmol/L）;(4)NE（MAGE1Hsp70）免疫组:注射纳米乳剂包裹的MAGE1Hsp70融合蛋白疫苗14μg（150pmol/L）;(5)MAGE1Hsp70/SEA免疫组:注射MAGE1Hsp70融合蛋白14μg（150pmol/L）和SEA蛋白0.042μg（1.5p