资源描述:
《ne(mhs)纳米乳剂疫苗的抗肿瘤免疫学效应研究》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、NE(MHS)纳米乳剂疫苗的抗肿瘤免疫学效应研究【摘要】目的:制备包裹有MAGE1Hsp70和SEA的复合抗原的纳米乳剂疫苗NE(MHS)(nanoemulsionencapsulatedMAGE1Hsp70/SEA),评价其抗肿瘤免疫学特性。方法:采用磁力超声法制备纳米疫苗NE(MHS),评价其粒径、包裹率及稳定性;NE(MHS)免疫动物,IFNγELISPOT和LDH杀伤实验检测疫苗激活机体特异性细胞免疫反应情况;肿瘤攻击实验检测纳米乳剂疫苗的抗肿瘤效应。结果:(1)成功制备出粒径为(20±5)nm的NE(MHS),其药物包裹率为87%,于4℃放置6个月后或3
2、000r/min10min离心后无分层;(2)与其他组相比,NE(MHS)组小鼠脾淋巴细胞中分泌IFNγ的T细胞数量明显增多(P<0.05),CTL对B16MAGE1的特异性杀伤作用明显增强;NE(MHS)组B16MAGE1肿瘤成瘤时间长、成瘤率低。结论:NE(MHS)纳米乳剂疫苗具有良好的理化性质,能够刺激机体产生强烈的MAGE1特异性的细胞免疫,能有效预防表达MAGE1的肿瘤细胞攻击,是一种很有希望的新型抗肿瘤疫苗。【关键词】纳米乳剂肿瘤疫苗MAGE1Hsp70SEA肿瘤疫苗作为预防肿瘤患者术后复发和转移的有力手段,近年来已得到广泛的研究和应用。目
3、前,13已有多种疫苗进入临床试验阶段。但是由于肿瘤免疫反应的复杂性,肿瘤疫苗距成为治疗型疫苗并真正走向临床实际应用尚有距离。考量各方面因素、综合各设计方案,本实验拟在已有研究的基础上,对所构建的肿瘤基因工程纳米疫苗进一步改进,并研究其抗肿瘤免疫学特性,为疫苗走向临床前研究打下实验基础。 1材料和方法 1.1材料 大豆油、poloxamer188、span80购自美国Gibco公司。C57BL/6小鼠由第四军医大学动物中心提供。MAGE1Hsp70蛋白、SEA蛋白由本实验室表达纯化制备。转MAGE1基因的小鼠黑色素瘤细胞由本实验室叶菁博士构建。ELISPOT检测试剂
4、盒购自法国DIACLONE公司。 Cytotox96检测试剂盒购自美国Promega公司。 1.2油包水型纳米乳剂NE(MAGE1/Hsp70+SEA,MHS)的制备 采用磁力超声法。具体:1.0mg复合抗原(融合蛋白MAGE1/Hsp70与超抗原SEA按摩尔比100∶1混合)、80g/LSpan20、180g/LPluronic188和0.6mL大豆油,双蒸水调整体积为2.513mL,混合均匀得到油相;在3000r/min磁力搅拌下,将油相逐滴加入7.5mL双蒸水水相中;将混合物移至真空高速剪切乳化机上,在0.7kpa真空下,23000r/min,高速剪切40m
5、in,温度控制在80℃以下;冰浴下40kHz超声5min,反复3次,即得到纳米疫苗(0.1g/L)。用0.22μm的滤膜过滤除菌后,于4℃保存。 1.3NE(MHS)的性质鉴定 1.3.1形态观察 将制成的NE(MHS)100倍稀释于生理盐水中,取100μL滴于400目铜网上,1min后吸去上清,10g/L磷钨酸染色1min,自然晾干后在透射电子显微镜下观察其形态。 1.3.2粒径检测 将采集的图象经计算机图象分析求得NE(MHS)的平均粒径。 1.3.3包裹率及稳定性测定 采用SephedexG100凝胶层析法,洗脱液为PBS,流速为0.5mL/min。
6、取NE(MHS)1.0mL上柱,13收集游离峰即为游离的MHS。将收集的游离MHS用分光光度计测定A280值。同时制备不同浓度的MHS标准蛋白样品,用分光光度计测定其光度值,并绘制浓度与光度值的标准曲线。以标准曲线为依据,计算出NE(MHS)中游离MHS的含量。包裹率按公式计算:包裹率=(W总-W游)/W总×100%。(W总为制备时所用MHS的总量,W游为游离的MHS的量)。将制备的NE(MHS)置于4℃冰箱保存6个月后或3000r/min10min离心后,电镜观察纳米乳剂形态,明确其稳定性。 1.4纳米乳剂蛋白疫苗的细胞免疫反应 1.4.1动物的分组、免疫和小鼠脾淋
7、巴细胞的分离与活化取4~6周龄的二级C57BL/6小鼠(H2b),雌雄不拘,体质量(18±2)g,随机分为6组,每组6只。分组情况为:(1)PBS对照组:PBS0.15mL/鼠;(2)NE(-)对照组:空白纳米乳剂0.15mL/鼠;(3)MAGE1Hsp70免疫组:注射MAGE1Hsp70融合蛋白14μg(150pmol/L);(4)NE(MAGE1Hsp70)免疫组:注射纳米乳剂包裹的MAGE1Hsp70融合蛋白疫苗14μg(150pmol/L);(5)MAGE1Hsp70/SEA免疫组:注射MAGE1Hsp7