基于fshr表位肽的纳米避孕疫苗的构建及其体内外效应研究

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1、万方数据第三军医大学硕士学位论文基于FSHR表位肽的纳米避孕疫苗的构建及其体内外效应研究摘要随着社会和经济的发展，男性参与家庭计划的意愿也日趋强烈，但可供选择的避孕措施十分局限。免疫避孕疫苗具有多重优点，被认为在男性避孕中将是最具前景的措施之一。促卵泡生成素／促卵泡生成素受体(Folliclestimulatinghomone／Folliclestimulatinghonnonereceptor；FSH／FsHR)信号参与调节启动精予发生和维持精子正常生成，是男性生殖中的重要环节；而且在男性FsHR仅表达于睾丸支持细胞，因此FsHR被选择成为避

2、孕研究的靶标之一。近期，基于FsHR避孕疫苗的研究获得了令人欣喜的成果，利用计算机表位预测技术筛选出的FsHR32_44肽段，经体内验证成功避免了以往FsHR疫苗对生殖器官损伤的副作用，并能诱导生育抑制的作用。但仍有一些局限性，尚不能应用于临床，如FsHR表位疫苗免疫原性差，诱导的抗体滴度低；联合使用的氟氏佐剂存在安全性问题；融合多肽载体引起免疫偏移诱导免疫损伤风险。基于纳米载体的递送系统具有安全、高效、靶向和副作用小的特点，在药物递送和肿瘤疫苗中已显示出独特优势。因此，为解决表位疫苗存在的上述问题，本研究拟设计并构建FSHR优势表位纳米疫苗。

3、本研究以前期实验中筛选的FsHR无病理损害优势表位为基础，使用pH敏感材料缩醛化B．环糊精(AcetalatedBetalatedtrin，Ac-bcD)和非敏感性材料聚(乳酸．羟基乙酸)(Poly(1actic—co．酉ycolicacid)，PLGA)为载体，设计构建具有不同pH特性的表位肽纳米避孕疫苗(FsHR／Ac．bCDNP和FSHR／PLGANP)，分别通过体外实验和体内实验研究纳米疫苗的免疫效应和抗生育作用。课题研究分为以下三个部分。一、不同pH响应性的FsHR纳米疫苗的制备及其表征以本实验室前期研究工作中筛选的FsHR优势抗原表

4、位(IELRFVLTKLRVI)为靶抗原，采用固相合成技术，人工合成高纯度的FsHR32．44肽段，分别使用Ac_bcD和PLGA材料作为载体，通过乳化法制备了FsHR纳米疫苗。结果显示，采用固相合成法获得的FsHR肽纯度大于95％，两种材料均能成功包载多肽，形成粒径200m左右的纳米粒，包封率60％以上。透射电镜(Transmissionelectronmicroscopy，TEM)和扫描电镜(scanningelectronmicroscopy，SEM)观察表明纳米粒形态规整、粒径分万方数据第三军医大学硕士学位论文布均匀，体外水解和释放实验

5、均证实FsHR／Ac_bcDNP有在pH5．0的溶液中快速水解的特点，可释放出FsHR多肽，而在pH7．4的溶液中和PLGANP一样呈缓释特征。二、FsHR表位纳米疫苗的体外免疫效应使用骨髓来源诱导培养的未成熟树突状细胞(Immaturedendriticcells，iDcs)进行体外评价。用不同剂型的FsHR多肽抗原刺激iDcs，利用激光共聚焦和流式细胞技术观察树突状细胞(Dendriticcells，Dcs)对抗原的吞噬能力和特点；并观察不同抗原刺激后Dcs的表型分子变化，以及诱导T淋巴细胞增殖和分泌因子的能力。结果表明，通过细胞因子诱导，

6、可以获得80％以上cDllc+的功能健全的iDc；纳米化抗原利于iDc吞噬，提高了抗原的摄取量，具有时间和剂量依赖特征；FsHR／PLGANP能有效刺激DCs，提高表面分子cD40、cD80、CD86和MHc．II的表达量；摄取了纳米抗原的Dcs能有效刺激T淋巴细胞增殖，并大量分泌炎症因子肿瘤坏死因子一Q(Tumornecrosisfactor—c【，TNF—c【)和丫一干扰素(Interferon_丫，IFN吖)，其中Ac-bcD和PLGA材料组无明显差异。三、不同pH响应性的FsHR纳米疫苗的体内效应研究选择C57BL／6J雄性成年小鼠作为

7、免疫对象，具体分组包括PBs(PhosDhatebuffers01ution，磷酸盐缓冲液)、FSHR、FSH刚CFA、FSHR／Ac-bcDNP和FSHR／PLGANP组：采用足垫皮内和皮下多点、多次免疫的方法。通过眼眶采血，ELIsA(EnzⅥne．1i11l(edimmunosorbentassay，酶联免疫吸附实验)法检测免疫前、后血清抗体滴度和睾酮水平变化：合笼观察雌鼠受孕率及产仔率评价对应组别雄鼠生育抑制程度，检测分析附睾精子质量；检查抗体水平下降后小鼠重要脏器和生殖器官的病理学变化，并利用硝酸镧示踪结合TEM观察血睾屏障完整性。该

8、部分研究结果显示FSHR／CFA、FSHR／Ac．bCDNP和FsH刚PLGANP组均可以诱导特异性抗体产生，纳米组抗体水平高于氟氏佐剂组，于初免后9