基于卵泡雌激素受体——fshr多肽避孕疫苗优化设计及其抗生育效应实验的研究

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1、第三军医大学博士学位论文基于卵泡雌激素受体---FSHR多肽避孕疫苗的优化设计及其抗生育效应的实验研究摘要FSH是垂体分泌的糖蛋白激素，对雄性精子的产生有至关重要的作用。实验表明阻断FSH或受体活性可以引起少精或无精。人们利用FSH这种生物学功能结合免疫学的理论和方法研究开发FSH/FSHR避孕疫苗。就FSHR避孕疫苗而言，其是通过受体抗体结合间接封闭FSH的生物学功能，抑制精子的生成达到避孕的目的。FSHR是G蛋白偶联受体,有669氨基酸组成，其胞外区是与FSH结合的关键部位。为避免与其它糖蛋白家族发生交叉反应而干扰其它激素的功能，因此对FSHR活性的表位

2、筛选具有重要意义。研究发现通过克隆技术表达的FSHRN端多肽(18～27、25～34、29～38氨基酸)可以避孕，而且生育力在停止免疫后逐渐恢复。以上研究无疑为避孕疫苗的研究带来了曙光。但也仍存在一些问题，如所应用的研究对象数目少，不具有代表性，生育力恢复实验仅为33.4%，其对生殖健康的远期影响尚需进一步的验证等。本实验室前期工作中用人FSHR重组蛋白免疫雄性小鼠后，导致小鼠受孕率明显下降。但一个严重的问题是带来生殖器管的损伤及睾酮的下降。考虑到FSHR蛋白免疫动物造成生殖器官损伤主要是因为蛋白表面含有多种表位，除中和表位外，其它表位如毒性表位、优势非中和

3、性表位等可能引起免疫偏移造成免疫损伤，因此为了减少其副作用，我们利用计算机联合预测结合人工合成的方法获得关于FSHR蛋白胞外区由13氨基酸组成的多肽，并采用不同剂量多肽初免、加强策略免疫雄鼠，观察其避孕效应及对生殖机能的影响，主要内容包括：1.利用各种生物信息学方法对FSHR胞外区蛋白进行二维结构分析、对B细胞表位筛选以及通过分子对接等综合预测，获得优势中和表位肽段，并对获得的肽段进行优化。并通过肽结合实验进一步验证筛选肽段的免疫原性，获得最终优化后B细胞表位多肽。2.使用不同剂量的FHSR多肽免疫雄性小鼠，在不同的免疫时期与正常受孕的雌鼠合笼（比例1:2）

4、观察雌鼠受孕率及产仔率。3.在观察不同剂量FSHR肽段对小鼠避孕效果同时，检测被免疫小鼠的生殖器官有无病理损害、了解被免疫小鼠的精子功能，以及性激素水平。主要采用的实验方法如下：1.采用DNAprotein软件对FSHR蛋白胞外区二级结构5第三军医大学博士学位论文AnalysisofB-cellepitopeofFSHRandstudyonitsanti-fertilitypotentialinadultmalemiceAbstractObjectiveFollicle-stimulatinghormone(FSH)isapituitaryglycoprot

5、einhormonerequiredfornormalspermatogenesisinmales.StudieshaveshownthatblockingFSHactivitycandecreasespermcounts.FSHactsthroughitsreceptor(FSHR)whichexpressesexclusivelyonthemembranesofSertolicellsoftestistoregulatespermatogenesis.Moreover,theextracellulardomain(ECD)ofitsreceptorisb

6、elievedtoberesponsibleforimportantspecifichormone-receptorcontactsites.MakinguseofthefunctionofFSHblockingspermatogenesis,someresearchersconductedsurveyusingpeptidesoftheECDofFSHRandfoundthatinfertilitycanbeinducedindifferentspecies.PrimingwithhumanrecombinantFSHRprotein(F140)andbo

7、ostingwithFSHR32-44aminoacidspeptideshowedspecificimmuneresponseandfertilityinhibitioninadultmalemiceinourpreviousstudy.However,itledtothereproductiveorgansdamage.Toavoidthepathologicalchangeandremaintheinfertility,weexploredthepeptideprime-booststrategyinmice.Methods1.Thepeptide,c

8、omprisingaminoacids32-44of