survivin反义寡核苷酸诱导k562细胞株凋亡的实验研究

《survivin反义寡核苷酸诱导k562细胞株凋亡的实验研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、Survivin反义寡核苷酸诱导K562细胞株凋亡的实验研究【摘要】目的探讨Survivin反义寡核苷酸对K562细胞株凋亡的影响。方法将K562细胞分为四组：反义组、无义组、脂质体组及空白对照组，通过脂质体将Survivin反义寡核苷酸转染入各组K562细胞，用免疫组化法测定转染前后K562细胞Survivin基因及Caspase3的表达差异，用Tunel及AnnexinVFITC测定各组细胞的凋亡率。结果Survivin基因在K562细胞高表达，转染反义核苷酸后其表达下降，转染Survivin基因反义核苷酸后Caspas

2、e3的表达较其它各组升高，K562细胞生长受抑，细胞凋亡率升高。结论Survivin反义寡核苷酸能够下调Survivin基因的表达，促进白血病细胞株K562的凋亡。【关键词】Survivin反义寡核苷酸K562细胞凋亡基因治疗【Abstract】ObjectiveTostudytheapoptosisofleukemiacellsinducedbyantisenseoligonucleotidetargetingSurvivin.MethodsOligonucleotidesofplexesinedbyimmunohistoc

3、hemistry(SABC).Anddetectedtheapoptoticrateofeachgroupethods:TunelassayandAnnexinVFITCassay.ResultsTheproteinofSurvivinisoverexpressinK562cells,butaftertreatedineTM）购自美国Invitrogen公司，Survivin山羊抗人多克隆抗体及Caspase3鼠抗人单克隆抗体均由美国SantaCruz公司提供，Tunel原位凋亡试剂盒由德国Roche公司提供，Annexin

4、VFITC凋亡检测试剂盒由晶美生物工程有限公司提供。1.2寡核苷酸Survivin反义寡核苷酸（5’CCCAGCCTTCCAGCTCCTTG3’）及无义寡核苷酸（5’GCCATGGCTACCTTAGCGTT3’）均由上海生物工程技术服务有限公司合成，两端各5个碱基硫代磷酸化修饰。1.3细胞培养白血病细胞株K562由重庆医科大学附属儿童医院外科研究室保存，DMEMF12细胞培养基及胎牛血清均购自Hyclone公司。K562细胞置37℃、5％CO2饱和湿度培养箱内培养。1.4实验分组分4组，反义寡核苷酸组（反义组）：反义

5、寡核苷酸＋脂质体＋转染液；无义寡核苷酸组（无义组）：无义寡核苷酸＋脂质体＋转染液；脂质体组：脂质体＋转染液；空白组对照组（空白组）：等体积的转染液。1.5转染取对数生长期的细胞，用不含抗生素及血清的DMEM培养液制成单细胞悬液，接种细胞悬液至6孔板，细胞数为3×105/孔，反义组及无义组加入寡核苷酸与脂质体稀释后的混合液中，反义寡核苷酸终浓度为0.555nmol/ml，无义寡核苷酸终浓度为0.544nmol/ml；脂质体组只加入相同剂量的脂质体；空白组只加入同体积的培养液，置37℃CO2孵箱中培养6h，培养之后，在不去除转染培养

6、液的情况下，每孔加胎牛血清，使血清终浓度为10％，放入CO2孵箱中继续培养。1.6免疫组化法测定转染前后Survivin基因及Caspase3的表达分别将转染后的4组细胞吹打离心，制成单细胞悬液，均匀涂在玻片中心，室温下凉干。冷丙酮室温下固定15min，3%H2O2溶液中室温下浸泡30min，以充分灭活内源性过氧化物酶；滴加封闭血清，置室温下20min，甩去多余液体；滴加相应一抗20μl，4℃过夜；加生物素化二抗20μl，37℃20min，滴加SABC试剂，37℃20min，PBS冲洗，DAB显色，显微镜下观察。同时PBS代替

7、一抗做阴性对照。阳性结果判断（采用染色强度及阳性细胞数进行评分）：染色强度分四级：阴性(0分)、淡黄色(1分)、黄色(2分)、棕黄色(3分)；阳性细胞数分五级：＜5%(0分)、6%～25%(1分)、26%～50%(2分)、50%～75%(3分)、＞75%(4分)；随机计数5个视野，每个视野计数200个细胞，计算阳性细胞率。两者的乘积作为最终的结果判断：0分（－）、1～4分（+）、5～8分（++）、9～12分（+++），评分越高说明阳性程度越高。1.7Tunel法检测细胞凋亡率［4］将4组细胞制备单细胞悬液，涂片，4%的多聚甲醛（

8、用0.01MPBS配制）在15～25℃条件下固定60min，用含3%H2O2的甲醇溶液孵育10min，在冰上（2～8℃）用透化液（含0.1%TritonX100的0.1%枸橼酸钠溶液）透化处理2min，每份标本加20μl的Tunel反应混合液（酶溶液与标记液以