罗仙子提取物对单核细胞与血管内皮细胞黏附的作用

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1、罗仙子提取物对单核细胞与血管内皮细胞黏附的作用　　罗仙子原名家蝇蛆,又称五谷虫,为传统中药材之一.罗仙子具有多种治疗效果,如调节免疫功能、促进组织愈合、降血脂和抗菌等功效[1].本课题组前期研究发现罗仙子粉及其提取物均能有效治疗动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)[2].　　目前研究认为炎症过程在AS的发病中扮演了重要作用,单核细胞和血管内皮细胞的黏附、迁移诱导了AS的形成.本研究观察相对分子质量30000以下罗仙子提取物对单核细胞与血管内皮细胞黏附的影响,并简要探讨其机制.　　1材料与方法　　1.1细胞和培养EA.hy926、THP-1细胞购买于中山大学实验动物

2、中心.EA.hy926培养采用10%胎牛血清DMEM低糖培养基,THP-1培养采用10%胎牛血清RPMI1640培养基,细胞均置于37℃、5%CO2浓度的培养箱中静置孵育培养.EA.hy926待细胞融合度达到80%进行传代,THP-1每隔2~3d,培养基变黄后进行分瓶.　　1.2试剂和仪器罗仙子提取物自制;单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)ELISA试剂盒(CUSABIO,中国);MTT(Sigma,美国);PBS(博士德,中国);重组人TNF-α(PeproTech,美国);DMSO(Amresco,美国);DMEM低糖培养基(

3、Hyclone,美国);RP-MI1640(Hyclone,美国);胎牛血清(Hyclone,美国);酶标仪(Bio-Rad,美国);倒置显微镜(Olym-bus,日本);CO2培养箱(HERAS,德国);超净台(江苏净化,中国).　　1.3罗仙子提取物的制备人工饲养家蝇幼虫,于2日龄采用冷热交替刺激后,次日对幼虫进行清洗、消毒处理后,按1∶3(m∶v)的比例加入单蒸水进行匀浆,匀浆液用200目的纱X过滤,得滤液;超声破碎:工作10s,暂停5s,交替工作15min;超高速冷冻离心机4℃,12000r/min,工作30min后收集上清液;滤液在-80℃冰冻2h后,进行冷冻干燥,得到

4、罗仙子粗蛋白质粉;蛋白粗粉重溶后分别通过100000分子超滤膜和30000分子滤膜获得相对分子质量30000以下罗仙子提取物.　　1.4内皮细胞活力检测取对数期生长期的EA.hy926,接种于96孔板,每孔200μL(1104/mL),细胞贴壁生长后48h更换培养液,按下列浓度加入系列浓度的相对分子质量30000以下罗仙子提取物的培养液(0、4102、4101、4100、410-1、410-2、410-3、410-4μg/mL),每组设6个复孔,37℃及饱和湿度下培养24h.每孔内加入20μL(5mg/mLMTT)溶液,继续培养4h.吸取孔内液体,加入150&m

5、u;LDMSO,在酶标仪OD490nm处测量各孔的吸光度值[3].　　1.5罗仙子提取物对单核细胞与TNF-α活化的血管内皮细胞黏附的影响EA.hy926接种于96孔板,待细胞培养至单层后,更换含有10ng/mLTNF-α和不同浓度药物(200、100、50、25、12.5、6.25和3.12μg/mL)的培养基,其中模型组只添加含有10ng/mLTNF-α的培养基,空白对照组使用空白培养基,处理24h后,在每孔加入3105个THP-1细胞,37℃及饱和湿度下培养1h,用PBS洗去未黏附细胞,每孔加入10μL虎红(0.25%),室温

6、下作用10min,用PBS洗去游离虎红,每孔加入200μL乙醇-PBS溶液(1∶1),作用1h后,采用酶标仪测定490nm的OD值[4].　　1.6罗仙子提取物对血管内皮细胞黏附分子表达的影响.　　EA.hy926接种于96孔板,待细胞培养至单层后,更换含有10ng/mLTNF-α和不同浓度药物(200、100、50、25、12.5、6.25和3.12μg/mL)的培养基,其中模型组只添加含有10ng/mLTNF-α的培养基,空白对照组使用空白培养基,每组3个复孔,处理24h后,收集培养上清液,离心去除细胞后采用ELISA试剂盒检测VCAM-1

7、和MCP-1.　　1.7统计学处理.　　用SPSS13.0软件进行统计分析,计量资料比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义.　　2结果.　　2.1罗仙子提取物对内皮细胞活力的影响4102μg/mL罗仙子提取物具有促进EA.hy926增殖的作用(P<0.05),而低于该浓度,罗仙子提取物对EA.hy926未见明显的增殖或抑制作用(P>0.05).见表1.　　　　2.2罗仙子提取物对单核细胞与TNF-α活化的血管内皮细胞黏附的影响通过TNF