压应力对人血管内皮细胞内皮脂酶表达和黏附功能的影响与机制

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1、实验材料1.主要试剂DMEM培养基美国Gibco公司胎牛血清中国杭州四季青公司马血清美国Hyclone公司胰蛋白酶美国Sigma公司二甲基亚砜（DMSO）美国Sigma公司MG132德国Calbiochem公司BCA蛋白含量测定试剂盒美国Hyclone公司Western-Blot发光检测试剂盒美国SantaCruze公司RT-PCR试剂盒美国Promega公司PCR试剂盒中国上海生工公司EL,GAPDH引物中国上海生工公司Trizol美国Invitrogen公司兔抗endotheliallipase多克隆抗体美国Cayman

2、公司兔抗IкBα多克隆抗体美国SantaCruze公司兔抗NF-кBp65多克隆抗体美国SantaCruze公司兔抗大鼠β-actinIgG中国武汉博士德公司辣根过氧化酶/FITC/罗丹明标记羊抗北京中杉金桥公司兔IgG其它试剂均为国产分析纯2.主要仪器普通光学显微镜日本Nikon公司荧光倒置显微镜日本Olympus公司(1×70)CO2培养箱美国Forma公司（3111）8超净工作台苏州安泰空气技术公司（SW-CJ-2FD）超纯水器美国PURELABMaxima公司酶联免疫检测仪Bio-Tek公司(Elx-800)流式细胞

3、仪美国BechmanCoulter公司(EpicsAltra)-80℃超低温冰箱日本三洋公司电子消毒柜日本Tomyseiko公司(SS-325)电子分析天平美国Sartorius公司(FA1004)微量移液器德国Eppendorf公司（2μl、10μl、100μl、200μl、1000μl）PCR仪美国伯乐公司（Mycyxler）水平电泳槽北京六一仪器厂(DYY-5)紫外分光光度计美国PerkimElmer(Lambda25)微量离心机美国Genofuge公司（16M）凝胶成像分析系统美国AlphaInnotech（2200

4、）高速低温离心机德国Eppendorf公司产品（5804、5804R）超声波细胞破碎仪宁波新芝科器研究所垂直电泳仪及转膜系统美国BioRad公司电热恒温槽上海佳胜实验设备有限公司（DK-600B）自制高压培养箱南华大学5%的CO2混合气衡阳特种供气站9实验方法一、液体和药物的配制1.DMEM培养基的配制：取一包粉末溶于800ml去离子水中，再加入3.7gNaHCO3充分搅匀，使之完全溶解，调节pH值至7.2-7.4，然后加去离子水至1,000ml，不锈钢滤器0.22μm滤膜过滤除菌，200ml分装，4℃保存，用时加10%的胎

5、牛血清。2.PBS缓冲液的配制：KCl0.2g、Na2HPO4·12H2O3.61g、KH2PO40.2g、NaCl8.0g加入去离子水至1,000ml，搅拌溶解，高压蒸气消毒，4℃冰箱保存备用。3.0.25％胰蛋白酶的配制：250mg胰酶溶于100ml无钙和无镁离子的PBS液中，然后经0.22μm微孔滤膜过滤除菌、分装，4℃冰箱保存备用。4.MTT的配制：5mgMTT溶于10mlPBS缓冲液中，搅拌使其完全溶解，然后经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃冰箱保存备用。5.0.1％DEPC水：1mlDEPC加双蒸水到1,000

6、ml，常温保存备用。6.75％无RNA酶的乙醇：75ml无水乙醇，加入25mlDEPC水（已灭菌），4℃冰箱保存备用。7.10mg/ml溴化乙啶：0.1g溴化乙啶溶于双蒸水中定容至10ml，充分搅拌完全溶解后，密封，铝箔包裹容器，4℃冰箱保存备用。8.5×TBE缓冲液：800ml双蒸水中溶解54gTrisbase，27.5g硼酸，用20ml的0.5mol/LEDTA(pH10值8.0)定容至1,000ml，4℃保存，出现沉淀即弃之。9.细胞膜穿透液：取250μltriton-100完全溶解于PBS溶液（pH值7.4）中，然后

7、加入5mlDMSO,完全混匀，定容至100ml备用。10.固定液：取150μl甲醇和50μl冰乙酸混合，4℃保存备用。11.细胞裂解液：10mmol/LTris·Cl(pH7.6)，100mmol/LNaCl，1mmol/LEDTA(pH7.6)，100μg/mLPMSF(临用时加入)，0.1mmol/LAprotinin(临用时加入)。12.30％聚丙烯酰胺：将29g丙烯酰胺和1gN，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于60ml双蒸水中,37℃溶解，定容至100ml，调节pH值不超过7.0，棕色瓶储存备用（隔数月重配）。13.1.5M

8、Tris·Cl(pH8.8)：将Trisbase18.165g溶于50ml双蒸水中，调节pH值至8.8，定容至100ml，4℃保存备用。14.1MTris·Cl(pH6.8)：将Trisbase6.055g溶于30ml双蒸水中，调节pH值至6.8，定容至50ml，4℃保存备用。15.10％