颠茄qpcr基因筛查及trⅱ基因表达概述

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1、颠茄qPCR基因筛查及TRⅡ基因表达概述第1章文献综述1.1实时劳光定量PCR(qPCR)技术研究简史1985年，KaryMuUis等人发明了具有里程碑意义的聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR)[i]。之后随着技术的不断发展，由于早期的PCR方法依赖于产物的终点浓度进行分析，而基于凝胶电泳终点的定量也都有着一定的局限性为了更为精确的检测样品mRNA的表达水平，1992年Higuchi首次提出，以溴化乙锭（EB)作为标记染料可以插入到双链核酸中接受激发光，并在P

2、CR反应的退火或延伸阶段检测掺入到双链核酸中EB的含量，这样就能实时监控整个PCR反应的进程[3]。但是当时这种技术反映的只能是PCR反应中混合液的总核酸量，并且检测方法由于缺乏特异性，不能做到准确的定量分析，存在着一些局限性[4]。而qPCR技术真正成熟起来，并得到一定程度的应用则是在1996年,这一年，美国AppliedBiosystems公司研制成功了世界上第一台定量PCR仪。从此，qPCR成为一种新的分子研究手段，开始逐步的得到认可。qPCR与普通PCR相比，其进步之处在于在反应体系中加

3、入了某种突光染料，并且此突光染料可以镶嵌在核酸片段分子中产生突光信号，而定量PCR仪则可以收集突光信号，并且通过软件处理数据，将收集到的突光信号用核酸片段的具体分子数目的形式表现出来。这样，通过对反应过程中突光信号的实时监测实现对PCR反应的全程监测，达到定量分析的目的[5]。该技术可以有效地避免普通PCR处理过程中所造成的假阳性，同时也省掉了电泳等后续分析过程。1.2qPCRqPCR是在普通PCR反应体系中加入荧光基团、染料或者探针，并且通过监测突光信号从而监测整个PCR进程，最后通过标准曲线

4、对样品未知初始浓度进行相对定量或者绝对定量分析[6]。生物的生长、发育、衰老或者病变通常因为相关基因在不同生长发育阶段或不同组织的差异性表达来决定。基因的表达差异最终表现出蛋白质合成多少的差异，并在一定程度上决定了相关细胞的激活、增殖、分化、病变或者调亡。定量分析样品mRNA的转录水平，能够帮助了解机体生长发育调控机理或病变机理，现下是当今基因研究领域的热点[7]。1.2.1qPCR基本原理突光探针技术（TaqMan技术）是以焚光探针为基础，实际上该技术是在PCR反应体系中引入了一个寡核苷酸探针

5、，此探针与被扩增DNA序列特异结合的部位在引物两端的中部，探针的5'端标记一个荧光报告基团（R)，而3'端标记一个焚光洋灭基团（Q)，Q和R可以构成能量传递结构，即R所发出的突光信号可被Q吸收或抑制。当探针完整时，5'端焚光报告基团发出的焚光信号会被3'端焚光萍灭基团吸收，于是检测系统就不能够检测到突光信号。在qPCR反应的退火阶段，探针和引物均与IEDNA特异性结合，在Taq酶的作用下，引物延伸至下游探针，此时Taq酶的5'-3'外切酶活性可以将

6、探针酶切降解，使焚光报告基团和焚光萍灭基团分离，从而突光监测系统就可以检测到焚光信号，即每有一条DNA链扩增，就会有一个突光分子形成，于是荣光信号的积累与PCR产物的扩增完全同步，这样就实现了定量[17]。该方法解决了焚光染料缺乏特异性的不足，另外反应结束后不需要进行溶解曲线分析，大大的缩短了实验时间。TaqMan技术缺点是成本较高，不方便普及和应用，定量的准确性主要依赖于Taq酶的5'-3'外切酶活性分子信标（molecularbeacon,MB)是近些年发展起来的一种新型DN

7、A突光探针，是一种自身可以形成莲环结构的杂交探针。该探针的两端核苷酸序列互补配对，因此标记在5'端的突光基团与标记在3端的萍灭基团紧紧相靠近，因此不能够发出焚光。分子信标的莲环结构中，环一般是15-30个核苷酸，并与目标序列互补，莲一般是5-7个核苷酸，并相互配对形成莲的结构。在热变性时，互补配对的莲环双链解开，环序列与模板配对，分子信标就由发夹形状变为了链状，使得突光基团与萍灭基团分开而发出焚光。在分子信标的设计时，最佳信标的杆的设计是实验成功的关键，必须要能够折叠正确的结构，焚光基团

8、如果不能立即靠近萍灭基团，则会导致背景信号过高。第2章绪论2.1研究目的和意义直蓉碱（hyoscyamine)和东黃蓉碱（scopolamine)属于托品焼类生物碱（Tropanealkaloids,TAs)，是两种重要的并且在临床上应用广泛的抗胆碱药，市场需求巨大。由于东莫碧碱具有更高的药效和低的副作用，需求更大。目前黃蓉碱和东直蓉碱的主要从節科析，颠莉的次生代谢产物相关研究也有了明显的进展，并取得了一些较理想的成果。但是，目前大多数的研究基本上都集中在TAs生物合成途径上的上游和下游的两个限