观察脊髓小胶质细胞是否参与大鼠内脏高敏的维持过程

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1、观察脊髓小胶质细胞是否参与大鼠内脏高敏的维持过程　　功能性慢性内脏痛是一组以腹痛或腹部不适同时伴有排便习惯及大便性状改变为主要特征的肠道功能性疾病，内脏高敏是其重要的病理生理学基础，但目前其分子生物学机制尚不清楚。长期以来，传统的观点认为疼痛在脊髓水平的调制和整合只与神经元有关，神经胶质细胞仅对神经元起支持和营养作用。然而，最近的文献报道，慢性疼痛时神经胶质细胞激活并且对疼痛的整合和传导起重要的作用。研究表明，脊髓小胶质细胞在功能性慢性内脏痛的启动发挥重要作用，而对内脏痛的维持作用尚未研究。本研究通过对

2、新生期大鼠给予结直肠扩张观察脊髓小胶质细胞是否参与大鼠幼年、青年到成年内脏高敏的维持过程。　　方法　　1.实验动物及动物分组新生第8天雄性Sprague-Dan;1）℃及12h/12h明/暗光照，能够自由取食和进水。随后大鼠正常饲养到第6（幼年）、8（青年）、12（成年）周进行下述各项实验。采用随机数字表法，将大鼠随机分为2组（n=15）：假手术组（S组）、新生期结直肠扩张组（CRD组）。　　2.试剂和仪器羊抗大鼠Iba-1（Abcam公司，美国），Alexa594驴抗羊IgG(LifeTechnolo

3、gies公司，美国)，BL-420E+生物机能实验系统（成都泰盟科技有限公司，中国），荧光显微镜（OlympusIX-81，日本）。　　3.功能性慢性内脏痛模型建立参照文献通过新生期反复结直肠扩张（colore-ctaldistension,CRD）的方法制备功能性慢性内脏痛模型：新生大鼠于出生后第8、10、12天，每天上午固定时间给予两次结直肠扩张，两次时间间隔30min。结直肠扩张是将直径3mm，长20mm的血管成形术导管从肛门插入至清醒新生大鼠的降结肠，用0.3ml水扩张产生60mmHg的压力在结

4、肠内留置一分钟后，将其减压退出。S组大鼠除未进行结直肠扩张外，其他操作均与CRD组一致。　　4.行为学检测（1）腹壁撤退反射（abdominal6cm8cm的有机玻璃箱内观察，约30min大鼠完全适应后开始实验。分别采用20、40、60、80mmHg四个压力，每次扩张持续20s，刺激间隔4min，取3次评分之均值。为了能客观比较S组和CRD组大鼠的各项指标，检测时采用单盲法，即对实验操隐瞒实验动物的类型。　　AmHg为一压力梯度，每个压力停留10s，间隔4min，以肉眼观察出现明显的下腹壁抬离箱底或明显

5、收缩变平（AmHg～80mmHg之间；每只大鼠重复三次，取平均值。　　（2）腹外斜肌放电的测量前述方法置入球囊后，将大鼠固定于手术台上，用1%左右的氟烷维持麻醉，并随时通过测量疼痛反应调整气体麻醉机内氟烷的流量，使大鼠不发生自主活动，却有疼痛反应存在。将银丝双极电极插入腹股沟韧带上方、距中线1.5cm的一侧腹外斜肌上，待适应15min后，对清醒大鼠予以结直肠扩张，压力梯度分别为20、40、60、80mmHg，每次加压10s，刺激间隔4min。用BL-420E+生物机能实验系统记录在不同压力的结直肠扩张刺

6、激下大鼠腹外斜肌的放电活动变化。记录参数设置：　　高频滤过2KHz，时间常数0.001s，采样频率为40Hz，灵敏度500?v，扫描速度250ms/div。实验环境要求安静，保持相对湿度在40％～70％，室温23℃～27℃范围之内。　　5.HE染色及免疫荧光　　两组大鼠于出生后第6、8、12周行为学测定结束后,每组随机取4只在10%水合氯醛腹腔注射麻醉下，迅速开胸暴露心脏经升主动脉插管，依次灌注4℃生理盐水200ml及4％多聚甲醛300ml，取距肛门10cm处肠段置于4％多聚甲醛后固定6h，移至30％蔗

7、糖脱水至组织沉底，常规石腊切片，HE染色，光镜观察肠粘膜形态，切片由徐州医学院病理科专家诊断，观察指标为结直肠局部组织有无损伤和炎症等异常改变。　　同时取脊髓L2～S4节段后固定，沉糖。用恒冷冰冻切片机切片（厚度30?m），于L2～S4脊髓节段每隔4片取1片，PBS漂洗5min3次，用含有0.3%TritonX-100的10%驴血清室温封闭2h，加入羊抗大鼠Iba-1抗体（1：200），4℃孵育24h，PBS漂洗5min3次，暗室内加入Alexa594驴抗羊IgG（1：200），室温孵育2h，PBS漂洗

8、5min3次，将切片贴于载玻片上，自然晾干后，90%甘油封片，立即用荧光显微镜观察及拍片。　　每个标本随机取L2～S4脊髓节段的5张切片，依Rexed分层法将脊髓灰质分成10层，以大鼠脊髓背角Ⅰ-Ⅱ板层来计数活化的小胶质细胞，并计算小胶质细胞活化率（活化的小胶质细胞数÷小胶质细胞总数100%）。静息状态小胶质细胞胞体较小，突起细长，荧光强度较弱；活化的小胶质细胞胞体增大，突起缩短增粗，荧光强度变深。　　6．统计学方法　　数据用