超声联合微泡对内皮祖细胞体外增殖、凋亡及细胞周期的影响

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1、超声联合微泡对内皮祖细胞体外增殖、凋亡及细胞周期的影响：范国峰，冯毅，童嘉毅，杨芳，马根山，姚玉宇【摘要】目的：体外探讨超声联合微泡对内皮祖细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响，为进一步体内研究提供科学依据。方法：体外提取、分离和培养猪骨髓内皮祖细胞，随机分为对照组、超声组、超声微泡组，干预后24h分别采用CCK8检测细胞增殖活性，PI染色流式细胞仪分析细胞凋亡坏死及细胞周期。结果：（1）低声强超声（0.25～1.0Hz,输出功率1.02（Cambrex公司）、纤维连接蛋白（Fn，Chemicon公司）；DiI

2、标记乙酰化低密度脂蛋白（DiIacLDL,MolecularProbe公司）、FITC标记荆豆凝集素I（FITCUEAI，Sigma公司）；CCK8试剂盒（碧云天生物科技研究所）、PI凋亡试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）；含氟碳气体脂质体微泡（东南大学生物工程材料国家重点实验室）、荧光正立显微镜（Nicon公司）、CZT3超声同步治疗仪（沈阳新乐康复医疗仪器厂）、BioRad酶标仪、FACSCalibur流式细胞仪。1.2细胞分离、培养和鉴定于雄性中国小型猪胫骨近端抽取骨髓约20ml，加入Fi

3、collPaque分离液，采用密度梯度离心法分离单个核细胞，以3×105的密度接种于铺有Fn的培养瓶中，培养液用EGM2。培养至7d左右行DilacLDL和FITCUEAI双染色，记数双阳性细胞为EPCs。1.3EPCs的干预培养细胞分为对照组、超声组和超声微泡组3组。实验前将培养的EPCs用胰酶消化制成单细胞悬液，摇匀后以100μl（约5×105ml-1）加入96孔培养板。对照组不做干预，超声组以频率1MHz、输出功率1.0-2持续辐照90s；超声微泡组加入5μl微泡（约2×108ml-1），以同

4、样超声条件作用90s。96孔培养板固定在37℃双蒸水水槽表面，超声探头垂直置于培养板下方约8cm处，为避免超声波对邻近孔细胞的影响，隔孔接种细胞，每组8孔。1.4CCK8测定细胞增殖活性当孔内细胞生长至60%～70%融合时,无血清培养24h，以0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0-2的不同声强超声联合微泡干预EPCs，继续培养24h后每孔加入CCK8溶液10μl，37℃孵育1～2h，酶标仪上以450nm测吸光度，细胞增殖越多、越快，则颜色越深，呈线性关系。1.5流式细胞仪检测坏死凋亡细胞及细

5、胞周期各组细胞干预后继续培养24h，收集细胞用1ml冷PBS制成1×105ml-1的细胞悬液,1000r·min-1离心10min，弃上清,将细胞重悬于200μl结合缓冲液中,加入PI液5μl，混匀避光室温反应15min，再加入300μl结合缓冲液,流式细胞仪以激发波长488nm检测，结果输入计算机，直接给出凋亡及坏死细胞百分比，同时获得DNA含量分布结果。1.6统计学处理采用SPSS14.0统计软件包进行数据分析，所有数据用x-±s表示，组间比较采用单因素方差分析（One-2不同声强超声微泡组的吸光度值分别

6、为1.344±0.177、1.305±0.159、1.301±0.110、1.234±0.101、1.063±0.093和0.759±0.078（图2）。与对照组（1.325±0.143）相比，0.25、0.5、0.75和1.0-2组对EPCs增殖活性无影响（P=0.840），1.5和2.0-2组EPCs增殖活性明显下降（P﹤0.05）。可见超声联合微泡作用对EPCs增殖活性无影响的最大超声能量是1.0-2，可以在获得最大生物效应同时安全用于实验研究。图2不同声强超声联合微泡作用下的吸光度（CCK8法）2.

7、4超声联合微泡对EPCs细胞周期的影响用流式细胞仪进行细胞周期分析表明，1.0Hz的超声(0.5、1.0，MAJIDE，etal.Globalandregionalburdenofdiseaseandriskfactors，2001:systematicanalysisofpopulationhealthdata［J］.Lancet,2006,367:17471757.［2］VINCENTFMS，RICHARDTL.Stemcelltherapyforcardiacdisease［J］.Nature,20

8、08,451:937942.［3］JIS，MINGQ，SANJIVK，etal.Stimulationofarteriogenesisinskeletalmusclebymicrobubbledestructionodelingandacceleratedhyperemiabloodflouscleexposedtoultrasonicmicrobubbledestruction［J］.AmJPh