吡格列酮对内皮祖细胞增殖、凋亡及功能的影响

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1、吡格列酮对内皮祖细胞增殖、凋亡及功能的影响作者：邸春霞，陆庆明，郭文怡，王海昌，张荣庆，殷忠【摘要】目的：观察不同浓度吡格列酮对大鼠骨髓源性内皮祖细胞（EPCs）增殖、凋亡和功能的影响，并探讨其可能的作用机制.方法：正常SD大鼠24只，随机分为A组（对照组）和B,C,D组［吡格列酮组剂量依次为10，20，40mg/（kg·d）］，灌胃处理10d后断颈处死，密度梯度离心法获取骨髓单个核细胞，经鉴定后证实为EPCs.每组细胞培养4d后消化、计数并用完全培养液培养.24h后检测NO生成量，3d后检测凋亡情况，7d后检测增殖能力.结果：与A组相比，B,C,D组EPCs增殖能力明显增高［B，C，D组A

2、490nm分别为（0.423±0.004）,（0.680±0.008）,（0.443±0.005）vsA组A490nm（0.143±0.006）,P<0.01］；凋亡程度降低［B，C，D组分别为(32.8±0.8)%，(30.9±2.3)%，(33.0±3.9)%vsA组(40.1±1.1)%,P<0.01］；培养上清中NO浓度显著提高［B，C，D组分别为（29.2±3.7），（41.0±7.7），（28.7±6.4）μmol/LvsA组（18.9±1.4）,P<0.05］；与C组相比，B组和D组促进EPCs增殖能力弱（P<0.01），培养上清中NO浓度相对低（P&l

3、t;0.05）.结论：不同浓度吡格列酮均能提高EPCs数量和功能；20mg/（kg·d）吡格列酮对EPCs的作用较强.【关键词】吡格列酮；内皮祖细胞；糖尿病0引言血管内皮在心血管疾病发病机制中起重要作用，多种心血管疾病都伴有内皮功能障碍.内皮祖细胞(EPCs)是血管内皮的前体细胞，在特定应激条件下可分泌促血管生长因子并参与内皮修复和新生血管形成（包括血管新生和血管发生）［1］.研究［2-3］发现，糖尿病患者的EPCs增殖能力减退，体外黏附、形成毛细血管的能力也降低.吡格列酮是一种噻唑烷二酮类胰岛素增敏剂，对2型糖尿病有较好的降糖效果和耐受性.研究［4］表明，吡格列酮可以促进EPCs介导的新生

4、血管形成，但具体作用机制不明.我们拟探讨体外培养条件下，不同浓度吡格列酮预处理对正常大鼠的骨髓源性EPCs增殖、凋亡及功能的变化，为改善内皮损伤提供实验依据.1材料和方法1．1材料雄性SD大鼠24只，体质量70～80g（第四军医大学实验动物中心）；M199培养基（美国Gibco公司）；胎牛血清（美国Hyclon公司）；血管内皮生长因子（VEGF，美国Biovision公司）；碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，英国Peprotech公司）；乙酰化低密度脂蛋白（DiIacLDL，德国Invitrogen公司）；胰岛素和荆豆凝集素I（FITCUEAI，美国Sigma公司）；AC133和CD

5、34（英国eBioscience公司）；flk1（美国Chemicon公司）；淋巴细胞分离液（天津灏洋生物制品科技有限责任公司）；NO检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；盐酸吡格列酮（成都宇洋高科技发展有限责任公司）.1．2方法1．2．1实验分组及吡格列酮干预将大鼠随机分为4组，每组6只，A组（对照组）给予9mL/L注射用生理盐水，B，C，D组分别给予盐酸吡格列酮10，20，40mg/（kg·d）.灌胃喂养10d.1．2．2分离培养EPCs颈椎脱臼法处死大鼠，剥去皮肤，取四肢置750mL/L乙醇5min；将骨两端软骨用无菌剪刀剪除，用M199培养液冲洗骨髓腔；将骨髓细胞悬液轻置于淋巴细胞

6、分离液表面、离心并吸取乳白色单核细胞层，M199培养液洗涤后用含VEGF，bFGF的完全培养液重悬、计数并接种到培养瓶中，4h后将培养瓶翻面.1．2．3EPCs表型鉴定培养6d的细胞用2.5g/L胰酶和0.2g/L乙二胺四乙酸消化并接种于盖玻片.24h后向细胞爬片孔内加入10mg/LDiIacLDL100μL并置37℃孵育1h，多聚甲醛室温固定10min，PBS漂洗后加入10mg/LFITCUEAI100μL，避光孵育1h，PBS洗涤、晾干后封片，激光共聚焦显微镜观察.1．2．4NO检测将培养4d的细胞消化、计数后以1.5×104/孔接种于96孔板培养.按NO试剂盒说明书，24h后于

7、每孔吸上清100μL，采用硝酸还原酶法特异性将各孔上清液中NO3-还原为NO2-，并测定NO2-浓度，从而间接反映NO含量.1．2．5凋亡检测将培养4d的细胞消化，不完全培养液(无血清)培养24h后加入含血清的完全培养液培养.3d后再次消化贴壁细胞，以1000r/min离心5min后弃上清，行双标记流式细胞术检测.1．2．6增殖能力检测分离EPCs并以1.5×104/孔接种96孔板.培养7d后向每孔培养液中加