匹格列酮对高同型半胱氨酸环境下内皮祖细胞功能的影响及其机制的研究

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1、浙江大学博士学位论文匹格列酮对高同型半胱氨酸环境下内皮祖细胞功能的影响及其机制的研究姓名：徐晟杰申请学位级别：博士专业：内科学指导教师：傅国胜20120530浙江大学博士学位论文中文摘要匹格列酮对高同型半胱氨酸环境下内皮祖细胞功能的影响及其机制探讨．浙江大学医学院博士研究生导师中文摘要心内科徐晟杰傅国胜教授越来越多的实验结果提示内皮祖细胞(EPCs)通过合成并分泌细胞因子来促进血管新生和内皮层的修复。其中血管内皮生长因子ⅣEGF)和白介素8(IL一8)在EPCs通过旁分泌因子促进血管新生和内皮修复的作用中扮演着主要的角色。血浆同型半胱氨酸(Hcy)

2、水平升高作为缺血性心血管病的一个独立危险因素，参与缺血性心血管病发病的多个环节，其机制十分复杂。研究发现，Hcy损害外周血EPCs的数量和功能。相关文献报道Hcv减少EPCs数量并损害其增殖、迁移和黏附功能，且随着Hcv浓度增加及作用时间延长，EPcs的数量减少和功能损害明显加重。随后的在体研究显示高Hcv血症患者外周血EPCs数量减少、功能减退。进一步研究提示Hcv加速EPcs衰老，伴随EPcs增殖和集落形成能力的损害。Hcv加速EPCs衰老可能跟EPCs端粒酶活性下降以及脂磷酸化水平的下降有关。尽管高Hcy引起EPC增殖、迁移等功能受损，但是，

3、Hcy是否影响EPcs的旁分泌功能目前并不清楚。因此，我们拟进一步观察Hcy对EPCs旁分泌能力以及旁分泌细胞因子在体内皮修复能力的影响。另外值得关注的是，Hcy影响EPCs功能损害的确切机制目前仍有待明确。作为过氧化物酶体增殖物激活受体丫(P啪)激动剂的一种，匹格列酮(pi091itazone，PIO)已被证明能够调节细胞粘附，迁移以及新生血管能力。研究发现，PIO可以抑制EPCs的凋亡并增加小鼠体内的血管新生。PIO亦可以改善糖Ⅱ浙江大学博士学位论文中文摘要尿病和冠心病病人体内的EPCs的迁移和粘附能力。但是PIO对EPCs的治疗作用是否包括改

4、善其旁分泌能力目前还有待进一步证实。因此，基于上述考虑，我们首先观察Hcy对于EPCs旁分泌细胞因子VEGF和IL．8的影响，EPCs旁分泌能力在体内对损伤内皮层的影响；PIO能否改善Hcy环境下EPCs的旁分泌，粘附和迁移能力及机制；PIO对NADPH酶亚基蛋白表达的影响。以下分三部分对本研究的方法、结果及结论作一简述。1同型半胱氨酸对内皮祖细胞旁分泌功能的影响目的：探讨Hcy体外干预EPCs对EPCs旁分泌功能的影响．方法：采用密度梯度离心法从健康人外周血获取单个核细胞，接种于人纤维连戡蛋白包被的培养板，培养7d后，采用激光共聚焦显微镜检测FI

5、TC．UEA．I及DiI．acLDL双染色鉴定EPCs，采用流式细胞仪检测其表面标志(vEGFR．2，CD34，CDl33)，进一步鉴定EPCs。采用不含细胞因子的培养基EBM．2替代正常培养基培养EPcs24h，通过real．血nePcR法检测EPcs细胞内细胞因子合成的变化，并采用ELISA法检测条件培养基中VEGF和IL．8水平。加入不同浓度的Hcy(10，50I100，200和500胆10l／I。)干预24h，观察量效关系。此外，采用20叽mol／L的Hcy分别干预不同时间(3，6，12，24和36h)，观察时效关系。采用球囊损伤法建立大鼠

6、颈动脉损伤模型，雄性Sprague．Da州ey大鼠在颈动脉损伤后分别按如下分组进行灌注：(1)正常对照组；(2)颈动脉损伤+单纯培养液；(3)颈动脉损伤+EPcs条件培养液；(4)颈动脉损伤+Hcy干预后EPCs条件培养液。一周后观察不同条件培养液对大鼠颈动脉内皮修复的影响。结果：与正常培养基相比，在不含细胞因子及血清的条件培养基培养环境中，EPCs大量合成VEGF和IL．8，而其他细胞因子如IGF’HGF’SDF．1。PDGF．BB和邗4的合成无明显变化。ELISA法检测EPCs条件培养基中vEGF，IL．8浓度分别为260．5钍32．09pg／

7、n11／1×106EPCs，15724．54士1817．24pg／n彤1×106EPCs。高浓度Hcy抑制EPcs分泌vEGF和IL．8。200pmol几浓度Hcy干预EPCs时间依赖性抑制III浙江大学博士学位论文中文摘要VEGF和IL．8的分泌。EPCs条件培养基显著促进大鼠颈动脉内皮层修复，体外受到Hcy干预的EPCs条件培养基的促内皮修复能力受到抑制。结论：EPcs合成分泌以vEGF和IL．8为主，通过旁分泌细胞因子可促进大鼠动脉内皮修复。Hcy显著减少EPCs旁分泌VEGF和IL-8，并损害EPCs通过旁分泌功能修复损伤动脉的作用。关键词

8、：内皮祖细胞；同型半胱氨酸；旁分泌因子；内皮修复2匹格列酮通过抑制PKC的表达和NADPH酶的活性逆转同型半胱氨酸下调的内