分子标记相关实验步骤

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1、实验一植物DNA的提取与分离一、目的：学习并掌握CTAB法提取植物总DNA的原理和操作步骤。二、原理和方法关于植物总DNA的提取方法相关文献报道很多，但从提取原理上看主要有二种:CTAB法及SDS法。1、CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）法：CTAB是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中(0.7mol／LNaCl)是可溶的。采用氯仿／异戊醇抽提蛋白质，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物溶液加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇。CTAB法提取DNA最初用于冷冻干燥的材料。其程序及试剂比例经适当改动后也

2、于新鲜植物组织及细胞器DNA的提取。用冷冻干燥材料提取时，使用1×CTAB。用新鲜材料提取时使用2×CTAB缓冲液。实验需要注意的问题是CTAB溶液在15℃以下会发生沉淀，所以含CTAB的溶液不能在低温下离心。与SDS法相比，CTAB法的最大优点是能很好地去除糖类杂质，对于含糖较高的材料可优先采用，该方法另一个特点是在提取的前期能同时得到高含量的DNA和RNA。2、SDS（十二烷基硫酸钠）法：其原理是利用高浓度的SDS，在较高温度(55～65℃)条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的作法使蛋白质及多糖杂质沉淀(有的是加5mol／L的K

3、AC于冰上保温，在低温条件下KAC与蛋白质及多糖结合成不溶物)，离心除去沉淀后，上清液中的DNA用酚／氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。SDS法操作简单，温和，也可提取到分子量较高的DNA，但所得产物含糖类杂质较多。三、材料、试剂和仪器1试验材料：新鲜或超低温冷冻干燥植物组织0.2g2试剂：无水乙醇，70％乙醇，氯仿2%CTAB提取缓冲液：2g/100mlCTAB100mmol/LTirs·Cl(pH=8.0)50mmol/LEDTA(pH=8.0)700mmol/LNacl(pH=8.0)3仪器设备：恒温水浴锅，离心机，移液器及配套枪头，离心管，研钵四、步骤1）取约

4、0.2g叶在含有750ul左右提取缓冲液的研钵中磨碎，后转至1.5ml的离心管中，60℃水浴30min～1h,其间轻轻颠倒2-3次；2）取出冷至室温，然后用等体积氯仿-异戊醇（24：1）轻轻混匀并颠倒约5～10min，然后10000r/min离心10min；3）轻轻取出，用一新的离心管移出上清液，然后用2倍体积的预冷(-20℃)无水乙醇沉淀；4）待DNA收缩成团后，将其用70%乙醇洗1～2次后,干燥,然后用无离子水溶解后保存在－20℃冰箱中备用。五、结果记录观察每个步骤中溶液的颜色、有无沉淀产生、沉淀物颜色等变化。实验二DNA的定量分析一、目的了解检验DNA定量分析的方法和原理，

5、熟悉检验提取DNA的质量，包括浓度与纯度的具体步骤和操作过程。二、原理和方法1、浓度DNA样品的浓度一般可根据其在260nm的吸收值来确定。50ug／ml的双链DNA对260nm紫外光的吸收值为1.0。凡是浓度大于0.25ug／ml的纯净DNA样品均可按此关系，由其OD260值求出其浓度。测定时因比色杯最小的容积为0.5ml，微量制备的样品总体积不过20～100ul，因此应从所制备的样品中取出少量稀释后进行测定，根据稀释样品的吸收值及释释倍数计算出原样品的DNA浓度。测定方法：取20ulDNA样品溶液，加dH2O至3ml，混匀后注入5ml的石英比色杯中，以dH2O为空白对照调零后

6、进行测定。DNA样品浓度(ug/ul)=OD260×样品稀释倍数×50/10002、纯度纯净的DNA溶液是透明的，用紫外分光光度计测定其260nm及280nm的吸收值比应为1.8。若OD260／OD280大于1.8，表明样品中有较多的RNA，这时应该用RNA酶重新处理样品，若比值小于1.6，则说明样品中蛋白质杂质较多，这时需要用氯仿重新抽提样品进一步去除去蛋白质杂质。三、材料、试剂和仪器1实验材料：提取的植物总DNA2试剂：纯水（dH2O）3仪器设备：紫外分光光度计，石英比色杯，烧杯、洗瓶四、步骤（1）预热分光光度计10～20min。（2）取两只5.0ml的狭缝石英比色杯，一只装

7、入3.0mldH2O作为空白溶液，校正分光光度计零点和透光度至100。（3）测定DNA的浓度与纯度：1）取20ulDNA待测样品，加dH2O稀释混匀至3000ul。2）将两只比色杯放置在分光光度计中，调整入射光波长分别为260nm、280nm的OD值。（每次用dH2O液调整零点：T＝100、OD＝0）。（4）DNA浓度与纯度的计算：DNA样品的浓度：DNA样品浓度(ug/ul)=OD260×N（样品稀释倍数）×50/1000DNA样品的纯度：OD260／OD280五、结果计算DN